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申请/专利权人：桂林电子科技大学

摘要：一种基于CRISPR‑Cas12a结合C3N4QDs与rGO‑MXene的荧光检测LDL的方法。首先制备C3N4QDs和rGO‑MXene，将氨基修饰的ssDNA通过酰胺反应连接与C3N4QDs表面。将LDL适配体与激活链复合成双链结构，连接与磁珠表面；通过与crRNA互补，将激活的CRISPR‑Cas12a作用于C3N4‑ssDNA，切割其表面ssDNA，导致rGO‑MXene无法对C3N4吸附与淬灭，C3N4QDs荧光强度未受影响，通过荧光变化实现LDL检测。该方法灵敏度高、线性范围宽、操作简单，最低检测限为0.01064ngmL。

主权项：1.一种基于CRISPR-Cas12a系统结合rGO-MXene的荧光检测LDL的方法，按以下步骤进行：步骤1：CRISPR-Cas12a信号放大体系构建（1）适配体-激活链aptamer-activator捕获探针的合成优化：合成优选的低密度脂蛋白LDL适配体序列，对LDL适配体进行验证；根据LDL适配体序列，设计出部分互补的DNA序列activator，将activator与aptamer混合，退化处理以形成aptamer-activator加入磁珠溶液中，活化，孵育；（2）aptamer-activator捕获探针对LDL结合：在上述磁珠溶液中加入LDL溶液，孵育；aptamer与LDL结合，释放activator；磁分离，activator存于上清液中；（3）CRISPR-Cas12a的crRNA序列设计与合成：根据LDL适配体序列，设计出的部分互补序列activator，结合crRNA固有骨架序列，最终设计出crRNA完整RNA序列；（4）Cas12a-crRNA复合物的制备：crRNA进行退火处理，形成发卡结构；然后将Cas12a蛋白和crRNA混合，形成Cas12a-crRNA复合物溶液；（5）激活CRISPR-Cas12a系统对ssDNA切割活性：将上清液加入到Cas12a-crRNA复合物溶液中，振荡孵育；形成激活反式切割活性的CRISPR-Cas12a系统；步骤2：rGO-Mxene和C3N4QDs的制备以及荧光传感器的构建（1）rGO-Mxene的合成：超声破碎单层氧化石墨烯GO溶液形成GO分散体，加入AA搅拌还原成rGO；MXene悬浮液超声和rGO混合搅拌，离心，干燥，形成rGO-MXene粉末；（2）C3N4QDs的制备：尿素与柠檬酸钠研磨混合，高压釜加热，得到黄色混合物；乙醇和超纯水清洗，离心；过滤膜过滤，干燥，所产生的固体为C3N4量子点；（3）荧光传感器的构建：C3N4QDs溶液中加入NHSEDC活化的ssDNA溶液，形成C3N4QDs-ssDNA溶液；与将激活的CRISPR-Cas12a溶液加入C3N4-QDs-ssDNA溶液中，避光孵育；加入rGO-MXene溶液，室温，孵育；将溶液定容，用以荧光检测；步骤3：LDL工作曲线的绘制（1）基于CRISPR-Cas12a系统和结合rGO-Mxene的LDL荧光传感器工作曲线：将不同浓度LDL激活的CRISPR-Cas12a溶液加入到C3N4QDs-ssDNA溶液中，避光孵育，加入rGO-MXene溶液，孵育；（2）将上述溶液定容，用以荧光检测；绘制工作曲线，计算出该传感器在荧光检测方面的最低检测限；步骤4：实际样品中LDL的检测（1）将实际样品加入到步骤1的磁珠溶液中，磁分离；将上清液加入到Cas12a-crRNA溶液中，激活CRISPR-Cas12a系统，并将其滴加到C3N4-QDs-ssDNA溶液中，孵育；加入rGO-MXene溶液，孵育；进行荧光检测，记录荧光信号；（2）根据步骤3所得到的工作曲线的线性回归方程，计算得到所述待测实际样品中LDL的浓度。

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