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申请/专利权人：南京康和细胞基因工程研究院有限公司

摘要：本发明公开了一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，包括以下步骤：S01、RNA提取与反转录：S11、加入0.3mL氯仿，摇匀后室温静置分层；S12、4℃下12000rpm离心10min；S13、转移上层水相于新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积预冷异丙醇混匀，4℃沉淀30min；S14、4℃下12000rpm离心10min；S15、弃上清，加入1.5mL70％乙醇洗涤沉淀，将洗液吸除干净，室温干燥5min；S16、加入20μL无RNA酶去离子水，吹吸使RNA沉淀充分溶解；S17、将总RNA加到1.5％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中快速电泳分离。该发明提供的便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，能够与抗原结合，若用抗标签的抗体检测，其信号明显强于用抗原直接检测，结果更加直观、可靠。

主权项：1.一种便于CART检测的噬菌体展示抗体库及其应用，其特征在于，包括以下步骤：S01、RNA提取与反转录：S11、加入0.3mL氯仿，摇匀后室温静置分层；S12、4℃下12000rpm离心10min；S13、转移上层水相于新的1.5ml离心管中，加入0.8倍体积预冷异丙醇混匀，4℃沉淀30min；S14、4℃下12000rpm离心10min；S15、弃上清，加入1.5mL70％乙醇洗涤沉淀，将洗液吸除干净，室温干燥5min；S16、加入20μL无RNA酶去离子水，吹吸使RNA沉淀充分溶解；S17、将总RNA加到1.5％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中快速电泳分离；S18、按以下顺序加入反转录反应物：模板RNA3μgoligodT18引物1μL无核酸酶的去离子水补至12μL70℃孵育5min，立即于冰上冷却； 42℃孵育40min，结束后-70℃保存；S02、抗体基因第一轮扩增及胶回收：S21、按以下顺序加入反应物 S22、按以下程序运行PCR扩增：94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min内需要扩增循环25次；S23、将扩增产物加到1％琼脂糖胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中电泳分离；S24、切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段；S03、抗体基因第二轮扩增及胶回收：S31、按以下顺序加入反应物 S32、按以下程序运行PCR扩增：94℃，4min→98℃，10s→59℃，40s→72℃，50s→72℃，10min内需要扩增循环15次；S33、扩增产物加到1％argarose胶孔中，1×TAE电泳缓冲液中电泳分离；S34、切取目标抗体重链可变区基因条带，按试剂盒说明回收抗体基因片段；S04、噬菌体展示抗体文库淘选：S41、宿主菌TG1活化：制备miniagar培养基平板，划线法过夜培养TG1于37℃培养箱；S42、磁珠洗涤及封闭：吸取50μl磁珠，置于磁力架上，吸附后吸去液体，1mLPBS重悬、洗涤两次，用1mL1.5％脱脂奶粉+1.5％BSA的封闭剂封闭1小时，去除液体；S43、抗原结合：按16μgmL的浓度将人源CD70蛋白用PBSpH7.2-7.4稀释至1mL，重悬磁珠，旋转孵育1小时；S44、库封闭：与抗原结合至磁珠同步，取1011pfu噬菌体病毒颗粒，用1mL1.0％脱脂奶粉+1.0％BSA的封闭剂旋转孵育1小时；S45、噬菌体结合：将磁珠置于磁力架上，去除液体，将封闭后的库加入磁珠，重悬并旋转孵育1小时，去除液体；S46、洗涤：用1mLPBST[0.01MPBS洗涤，再用0.01MPBSpH7.4洗涤；S47、洗脱：吸去液体，用300μL0.2M甘氨酸-盐酸pH2.2洗脱10min，加入20μL中和液[1MTris-ClpH9.0]混匀，暂时保存于4℃；S48、测滴度：取2μL的第一洗脱液、由原液用2×YT培养基稀释10倍后取2μL的第二洗脱液、0由原液用2×YT培养基稀释100倍后取2μL的第三洗脱液，第一洗脱液、第二洗脱液和第三洗脱液与0.2mL对数中期OD600＝0.5的TG1混匀，室温孵育30min，均匀涂于2×YT-GA100平板上，37℃过夜培养，计数约50个克隆的平板上的克隆数，根据稀释倍数计算滴度；S49、噬菌体扩增：在淘选进行的同时，挑取miniagar平板上的TG1单克隆，接种于10mL2×YT培养液中，37℃下，250rpm振荡培养至对数中期OD600＝0.5；再加入200μL淘选获得的洗脱产物，37℃孵育30min，再加入辅助噬菌体M13KO7，37℃再孵育30min，37℃下，250rpm振荡培养1小时，离心去上清，用20mL包含工作浓度100μgmL氨苄青霉素和工作浓度50μgmL卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜；S50、噬菌体沉淀：10000rpm离心15min去除菌体，上清中加入15体积的2.5MNaCl20％PEG8000，冰浴2h，10000rpm离心10min得到噬菌体沉淀，将残液去除干净，加入0.2mL0.01MPBSpH7.4液重悬沉淀，如上文测滴度；S51、重复步骤41-50两次或者三次，以获得结合力强的噬菌体展示抗体；S06、单克隆ELISA：S61、将链霉亲和素包被酶标板用PBS洗涤2次，加入300μL工作浓度为2％的脱脂奶粉PBS封闭液，37℃孵育1h，进行封闭，BS洗涤2次；S62、每孔加入100μL浓度为1μgmL的CD70蛋白，37℃孵育30min，PBS洗涤3次洗；S63、从2×YT-GA100平板上挑取的单克隆菌落，振荡培养至对数中期，加入辅助噬菌体M13KO7，37℃孵育30min，37℃，220rpm振荡培养1小时，4000rpm离心15min；再用400μL含工作浓度100μgmL氨苄青霉素和工作浓度50μgmL卡那霉素的2×YT重悬，30℃，220rpm振荡培养过夜，4000rpm离心15min，沉淀菌体；S64、取50μL4％BSAPBS加入到酶标板中，同时取50μL噬菌体上清，混匀，孵育1小时；S65、去除液体，0.1％PBST洗5次，PBS洗3次，去除液体；S66、将HRP标记抗M13噬菌体抗体用2％BSA稀释3000倍，取100μL加入到酶标板中，孵育1小时，去除液体，0.1％PBST洗3次，拍干残液；S67、加入100μLTMB显色液，37℃孵育10min或至蓝色充分显现，加入100μL1M硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450；S07、T细胞分离与慢病毒感染：S71、运用试剂盒EasySepTMHumanTCellIsolationKitSTEMCELL从人外周血中分离出T细胞；S72、按细胞：磁珠＝1:3比例加入抗CD3CD28磁珠，用X-VIVO15LONZA培养基培养24h即为转染前的T细胞；S73、按每1×106T细胞加入100μL病毒液、4μgmLpolybrene和100IUmLIL-2；S74、24h之后，加入新鲜的培养基并调整细胞密度至5×105mL，37℃，5％CO2继续培养；S75、每隔2～3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5～1×106mL，培养时间为8～14天；S08、流式细胞术检测CART：S81、1500rpm离心5min收集CART细胞；S82、10mLPBS重悬细胞，再次1500rpm离心5min收集CART细胞；S83、对于对照组细胞，用200μLPBS重悬细胞，按100μL分为2管，其中一管加入2μLAlexaFluorTM647标记的人源CD70蛋白，避光室温孵育40min；S84、对于实验组细胞，用200μLPBS重悬细胞，按100μL分为2管，其中一管加入1μLAlexaFluorTM647标记的抗His标签抗体，避光室温孵育40min；S85、1.5mLPBS洗涤细胞两次，100μLPBS重悬细胞，流式细胞仪上机检测。

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