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申请/专利权人：中国科学院深圳先进技术研究院;华大青兰生物科技(无锡)有限公司

摘要：本发明公开了一种体外大片段基因组DNA的合成组装方法，该方法采用双链DNA粘性末端的生成系统，生成系统包括DNA组装序列、单链引导DNA、切刻内切酶A、切刻内切酶B、切刻内切酶C，DNA组装序列自5’端至3’端包括第一切刻内切酶识别位点单元、目标DNA序列和第二切刻内切酶识别位点单元，将基因组序列分成n个目标DNA序列，制备DNA组装序列，设计并合成单链引导DNA，向每个DNA组装序列、单链引导DNA中加入切刻内切酶A、切刻内切酶B和切刻内切酶C，进行酶切处理；将酶切后的DNA组装序列进行DNA体外组装。本发明克服了限制性内切酶产生短悬臂的限制并提高大DNA分子组装的成功率。

主权项：1.一种双链DNA粘性末端的生成系统在体外大片段基因组DNA的合成组装中的用途，其特征在于，所述系统包括DNA组装序列、单链引导DNA、切刻内切酶A、切刻内切酶B、切刻内切酶C；所述DNA组装序列自5’端至3’端包括第一切刻内切酶识别位点单元、目标DNA序列和第二切刻内切酶识别位点单元，所述第一切刻内切酶识别位点单元包括2或3个切刻内切酶A识别位点和位于所述切刻内切酶A识别位点之间的间隔碱基，所述第二切刻内切酶识别位点单元包括2或3个切刻内切酶B识别位点和位于所述切刻内切酶B识别位点之间的间隔碱基，所述切刻内切酶A和切刻内切酶B属于同类切刻内切酶，所述切刻内切酶A和切刻内切酶B的切割位点位于DNA的上下两条链上，所述DNA组装序列经切刻内切酶A和切刻内切酶B酶切处理后在DNA组装序列两端分别形成单链区；所述单链引导DNA包括第一单链引导DNA和第二单链引导DNA，所述单链引导DNA由靶序列的识别序列和折叠成茎环结构的短DNA序列组成，所述靶序列为单链DNA序列且包括所述单链区的部分序列以及其相邻目标DNA序列的部分序列，该单链区的部分序列被称为第一靶序列，相邻目标DNA序列的部分序列被称为第二靶序列，所述短DNA序列折叠成的茎环结构具有切刻内切酶C识别位点，但缺少可被所述切刻内切酶C切割的序列，所述靶序列的识别序列与第一靶序列杂交后，第二靶序列所对应的另一条DNA链被分离，靶序列的识别序列进一步与第二靶序列杂交，靶序列与识别序列杂交形成双链结构，该双链结构可被所述切刻内切酶C识别，并使第二靶序列的预定位置处于可以介由所述切刻内切酶C对单链引导DNA上的识别序列的识别而被所述切刻内切酶C切割的位置，所述第一单链引导DNA和第二单链引导DNA的靶序列的识别序列分别与经切刻内切酶A和切刻内切酶B酶切处理后在DNA组装序列两端形成的单链区的部分序列以及其相邻目标DNA序列的部分序列杂交形成双链结构。

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