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申请/专利权人：厦门先能生物科技有限公司

摘要：本发明公开了一种实现多重RNA原位检测的原位测序文库的构建方法，利用特殊设计的核酸探针技术构建了原位测序文库，利用原位测序技术和荧光显微成像技术实现了高度多重的RNA原位检测；将完整标签序列放置于识别探针对的两条链上，与放置于整个标签放置于一端相比，缩短了测序位置与连接位置的平均距离，提高了信号强度和特异性。

主权项：1.一种多重RNA原位检测方法，所述方法用于非诊断或非治疗目的，所述方法以结直肠癌石蜡组织切片作为实验样品、以30种目标mRNA作为RNA原位检测的对象，其特征在于：包括如下步骤：1根据所述30种目标mRNA上的靶序列设计三十组识别探针对；每一组识别探针对由一上游识别探针和一下游识别探针组成，上游识别探针含有上游标签序列，下游识别探针含有下游标签序列，上游标签序列和下游标签序列组成一完整标签序列用于解读其对应的靶序列，所述识别探针对的信息如下表所示： 2将步骤1所得的三十组识别探针对输送入所述结直肠癌石蜡组织切片的细胞内，使其与目标RNA上的靶序列识别并杂交，其中上游识别探针的3’端与下游识别探针的5’端相互靠近，通过能够以RNA为模板连接DNA的DNA连接酶相连形成相应的链状DNA分子，所述能够以RNA为模板连接DNA的DNA连接酶为SplintR连接酶；3将步骤2所得的链状DNA分子与如SEQIDNO.61所示的DNA夹板序列杂交，使相应的链状DNA分子的5’端和3’端靠近、然后通过DNA连接酶相连形成相应的环状DNA分子；4以步骤3所得的环状DNA分子为模板，用T4DNA连接酶和Phi29DNA聚合酶进行滚环扩增，获得扩增产物，即为原位测序文库；5通过四轮原位核酸检测对所述原位测序文库中的不同的标签进行解码，获得每一扩增产物上的完整标签序列，进而得知不同扩增产物检测的目标RNA的种类，获得不同目标RNA的原位表达信息，实现多重RNA原位检测；所述四轮原位核酸检测包括如下步骤：a锚定引物杂交和荧光探针连接；锚定引物和荧光探针的信息如下表所示，表中的n为a、t、c、g中的任一种： ；b荧光探针的洗脱；c将步骤a和b再反复三次；d基因的解析：综合四轮测序的信号，每个信号点得到四轮的颜色顺序，对应之前设计的探针上的碱基顺序得知该点为何种基因的信号。

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