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申请/专利权人：中国检验检疫科学研究院

摘要：本发明涉及一种鉴别冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的方法，该方法采用iTRAQ技术对冰鲜和冻融处理三文鱼中的蛋白进行定量和定性分析，筛选出与三文鱼冻融后品质变化相关的差异蛋白，并利用多反应检测模式对这些蛋白做了进一步验证，为解释冻融处理后的三文鱼品质变化规律奠定了理论基础。本发明的鉴别方法为三文鱼品质评价和控制提供了研究思路和科学依据，也为进口的三文鱼品质鉴别提供了技术支持。

主权项：1.一种应用iTRAQ技术确定冰鲜三文鱼和冻融三文鱼的差异蛋白的方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）采集冰鲜和冻融处理的三文鱼样品，提取样品中的蛋白；（2）对步骤（1）获得的蛋白质样品进行酶解、iTRAQ标记、分离肽段及LC-MS质谱分析；（3）对步骤（2）获得的蛋白质谱数据进行定性和定量分析，筛选两次重复数据进行t-test检验，p值小于0.05的蛋白，以及差异倍数（Foldchange）1.2或0.83的差异蛋白进行功能注释和代谢通路分析；（4）对步骤（3）所得差异蛋白进行MRM验证，获取冰鲜和冻融三文鱼蛋白组的变化情况；所述步骤（1）中提取三文鱼蛋白的方法为尿素法，并用Bradford法测定蛋白浓度；所述步骤（2）中采用Durashell-C18色谱柱对标记后的肽段进行分级，将分级后的肽段用流动相A溶解后上样到液质联用仪，进行梯度洗脱并进行质谱检测，其中流动相A为含有0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含有0.1%甲酸和2%水的乙腈溶液，流动相流速为0.265mLmin；所述步骤（2）中质谱条件为：采用正离子扫描模式，扫描范围350-1500mz；雾化器（GS1）：50psi；辅助加热气（GS2）：50psi；气帘气（CUR）：35psi；离子源温度（TEM）：550℃；去簇电压（DP）：80V；离子碰撞能量（CE）：10V；所述步骤（3）中蛋白数据处理是使用ProteinPilot5.0.2软件对质谱结果进行统一和数据转换，三文鱼物种原始蛋白库于Uniprot上进行下载；所述步骤（3）中功能注释的方法为：利用欧洲生物信息研究所维护的QuickGO注释工具对差异蛋白进行基因本体功能注释；所述步骤（3）中代谢通路分析的方法为：利用京都基因和基因组百科全书数据库对差异蛋白质进行代谢通路分析；所述步骤（4）中MRM验证的具体步骤为：利用Triple-TOF6600质谱对冰鲜和冻融三文鱼肌肉全蛋白分别进行扫描，ProteinPilot5.0.2软件进行搜库，将质谱数据进行转化，找到已鉴定的目标差异蛋白的肽段，利用Skyline软件构建离子对，其中每个肽段选取3-6个离子对使用NexeraX2液相色谱仪串联QTrap-5500质谱进行MRM验证；然后选取3个响应高、质荷比在150-1250mz之间的离子对进行定量，对比差异蛋白变化倍数和离子对峰面积变化倍数；所述步骤（4）中找到已鉴定的20个目标差异蛋白，其中15个蛋白下调，5个蛋白上调，所述20个目标差异蛋白的UniProt登录号为B5DGE7、B9ELE8、B5RI29、A0A1S3PT89、B5DGT9、B5DG55、A0A1S3KKP9、B5DGL3、A0A1S3M1A4、C0PUH3、A0A1S3KNT1、A0A1S3QRR9、A0A1S3NGD5、B5DG30、B5DFT9、B5DGZ1、B5DH07、A0A1S2X0C2、A0A1S3R5J0和B5DH17。

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