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申请/专利权人：禾旭(郑州)生物技术有限公司

摘要：本发明属于食品和饲料检测技术领域，具体涉及一种毒素三联化学发光检测试剂盒及其应用，方法包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；步骤四、对样品进行前处理；步骤五、将样品、亲和磁珠、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测。本试剂盒可实现样品即时检测，操作方法简单，不需要洗涤，样品和试剂混合即可出结果，而且同时可以检测三种真菌毒素残留，实现了检测的集约化，自动化，本试剂盒极大的减少了检测人员的工作量和时间，检测结果准确可靠，检测效率高，重复性，精密性和稳定性好。

主权项：1.一种毒素三联化学发光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、制备毒素与猝灭剂偶联物；步骤二、将毒素单抗与发光剂进行偶联制备单抗发光物；步骤三、制备纯化毒素的亲和磁珠；步骤四、对样品进行前处理；步骤五、将已处理样品、毒素淬灭剂偶联物和单抗发光物，放入自动化设备进行检测；其中，所述步骤三亲和磁珠的制备，包括：S31、使用涡旋混匀器将羧基磁性微球充分混匀悬浮，取30mg到离心管中；将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；加入3mL的pH6.0MES偶联缓冲液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液；再加入3mL的pH6.0MES偶联缓冲液；重复此洗涤步骤4次；S32称取20mg的NHS,加入1mlpH6.0MES偶联缓冲液溶解，称取20mgEDC加入1mlpH6.0MES偶联缓冲液溶解，然后在磁珠溶液中加入EDC溶液0.3mL和NHS溶液0.6mL，补加偶联缓冲液至总体积为3mL，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件活化反应30min后按照S31洗涤2次；S33将洗涤后活化磁珠用3mlpH6.0MES偶联缓冲液复溶，平均分成3管，每管1ml，然后分别加入500μgAFB1抗体、500μgZEN抗体、500μgDON抗体，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温条件下反应6h后按照S31洗涤2次；S34分别向各管加入1mL封闭液，涡旋分散磁性微球；保持磁性微球混悬状态，在室温或25℃条件下反应2h，按照S31洗涤2次；S35分别向各管加入1mL保存液，涡旋分散磁性微球后，将离心管放置在磁力架上5min，移除上清液，重复此步骤3次；最后分别再向各管加入1mL保存液，涡旋混匀，得到浓度为10mgmL的磁性微球混悬液，4℃下保存；所述步骤一具体包括黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联、玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联和呕吐毒素与BHQ2的偶联；其中黄曲霉毒素B1与BHQ1的偶联和玉米赤霉烯酮与BHQ1的偶联的步骤为：S11、称取20mg黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮标准品，加入5ml吡啶溶解；S12、称取羧甲基羟胺半盐酸盐40mg，并加入4ml吡啶溶解；S13、将4ml配好的羧甲基羟胺半盐酸盐加入到5ml黄曲霉毒素B1或玉米赤霉烯酮溶液中，避光室温搅拌反应22小时；反应完毕后，放入真空干燥机，25℃温度下抽干；S14、加入5ml无水甲醇，震荡溶解，然后放入真空干燥机，25℃温度下抽干，然后再重复一次此步骤；S15、加配好的pH8.0的水溶液5ml，震荡溶解，然后加5ml二氯甲烷，震荡3min，8000rpm离心2min，然后去掉二氯甲烷层，然后再重复一次此步骤；S16、下层水层加6molL的HCl调pH至3.0，会有沉淀析出，然后加5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；S17、称取5g无水硫酸钠，加入20mlN-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；S18、称取23mg的NHS，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmolL；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmolL；吸取2ml二甲基甲酰胺把抽干的物质溶解，然后再加入1200μl100μmolL的NHS和1200μl100μmolL的DCC，25℃过夜搅拌22h；S19、称取64mgBHQ-1amine加入10ml0.05MpH9.6的CB溶解，将反应好的半抗原按10μl每次慢慢加入BHQ-1溶液中，然后放置于4℃环境搅拌过夜；S110、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存；所述呕吐毒素与BHQ2的偶联的具体步骤为：S21、称取5g无水硫酸钠，加入20ml吡啶震荡1min，然后静置10min，抽取上层吡啶备用；S22、称取20mg呕吐毒素标准品，加入5ml吡啶溶解；S23、称取70mg丁基硼酸加入2ml无水吡啶，溶解后，加入到溶解好的呕吐毒素中，震荡混匀，密封避光25℃静置18h；S24、称取140mg琥珀酸酐加入到2ml无水吡啶中溶解，溶解完毕后，加入到已反应18h的呕吐毒素中，震荡混匀，抽真空，抽完真空后把瓶子密封，然后沸水浴120min；沸水浴完后，抽真空干燥，随后加入2ml氯仿震荡溶解，再加入2ml纯水剧烈震荡2min，吸出上层水相；重复此步骤四次，把吸出的水相进行合并，然后真空抽干；抽干后水相用2ml纯化水震荡溶解，然后用呕吐毒素亲和柱做亲和纯化，纯化后真空抽干；S25、称取5g无水硫酸钠，加入20mlN-N二甲基甲酰胺震荡1min，然后静置10min，抽取上层N-N二甲基甲酰胺备用；S26、称取23mg的NHS,加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmolL；称取42mg的DCC，加入2ml二甲基甲酰胺溶解，此浓度为100μmolL；吸取3ml二甲基甲酰胺把抽干的呕吐毒素溶解，然后再加入1200μl100μmolL的NHS和1200μl100μmolL的DCC，25℃过夜搅拌22h；S27、称取70mgBHQ-2amine加入10mlCB0.05MpH9.6的BC溶解，将反应好的半抗原按10μl每次慢慢加入BHQ-2溶液中，然后放置4℃搅拌过夜；S28、15000rpm离心10min，去除沉淀，把溶液pH调到3，用5ml乙酸乙酯抽提，震荡2min，8000rpm离心2min，取上层乙酸乙酯到另外一个离心管，重复5次，把上清乙酸乙酯合并，放置到真空干燥机，25℃抽干；S29、把沉淀用5ml甲醇溶解，避光保存备用；所述步骤二包括，量取2.6mgml的黄曲霉毒素B1单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mgmL；称取2.5mg6-FAMNHSEster，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液,缓缓加入到黄曲霉B1单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的6-FAMNHSEster和盐类小分子,得到标记的6FAM-AFB1单抗发光物；所述步骤二还包括，量取3.2mgml的玉米赤霉烯酮单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mgmL；称取3mgAttoRho6GNHSester，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到玉米赤霉烯酮单抗溶液中，一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的AttoRho6GNHSester和盐类小分子，得到AttoRho6G-ZEN单抗发光物；所述步骤二还包括，量取2.8mgml的DON单抗5ml，用分子量10万Millipore超滤管超滤2次，中间超滤缓冲液为PBS，超滤完成后用PBS调整蛋白浓度为5mgmL；称取2.6mgCy5NHSester，加入200μlN-N二甲基酰胺溶解，溶解完成后的溶液缓缓加入到DON单抗溶液中,一边加一边搅拌，然后25℃条件下避光反应1h，反应完成后放入分子量量10万Millipore超滤管超滤4次，除去未标记的Cy5NHSester和盐类小分子,得到Cy5-DON单抗发光物。

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