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申请/专利权人：上海美吉生物医药科技有限公司

摘要：本发明公开了一种微量DNA的emQPCR多靶标联检的方法、试剂盒及用途，所述方法包括如下步骤：1）乳液微滴巢式多重PCR预扩增，将水相与油相按一定比例制备生成油包水微液滴体系，随后，制备好的微液滴体系进行10~20cycle的巢氏PCR预扩增；微液滴预扩增后，破乳，得到水相的预扩增产物；2）多重巢式实时荧光PCR扩增检测，使用针对每个检测靶标的一组“嵌套”引物探针，通过这组“嵌套”引物探针组实现高特异性单管多重第1轮巢式预扩增和第2轮荧光PCR扩增多联检。本发明为血流感染以及骨关节感染等病原菌检测提供了一种高灵敏、有效快速的分子检测方案。

主权项：1.一种不以疾病诊断为目的的微量DNA的emQPCR多靶标联检的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）基于乳液微滴反应体系的第1轮单管巢式多重乳液PCR预扩增：将水相和油相混合进行微液滴制备生成不低于40000个油包水乳液微滴，然后将所述制备获得的乳液微滴分别收集到带密闭胶盖的PCR八连管中，之后进行10~20cycle第1轮单管巢式多重乳液PCR预扩增；所述水相中正反向引物终浓度为0.1~0.9μM，正反向引物对扩增产物片段大小150~450bp；所述第1轮巢式多重乳液PCR预扩增的程序为95℃10~100s；94℃5~30s，52~62℃10~60s，10~20个循环；（2）破乳分离水相和油相：所述步骤1）第1轮单管巢式多重乳液PCR预扩增后，产物破乳分离水相和油相，得到水相的巢式多重乳液PCR第1轮预扩增产物；（3）第2轮多重实时荧光PCR多联检：以步骤2）获得的水相的巢式多重乳液PCR第1轮预扩增产物为模板，加入8个检测靶标及内标基因的特异性修饰引物对和探针组，进行第2轮多重实时荧光PCR扩增，对微量的病原体核酸进行多靶标荧光扩增分析检测；所述8个检测靶标基因进行第2轮多重实时荧光PCR的特异性修饰内引物和修饰探针组终浓度分别为0.05~0.5μM和0.05~0.3μM；所述第2轮多重实时荧光PCR扩增的程序为37℃2~5min，95℃1~5min，95℃10~30s，63~55℃30~90s，30~45个循环，60℃→90℃采集荧光。

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