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申请/专利权人：河北科技师范学院

摘要：本发明公开了肠炎沙门菌mcpC基因缺失株的构建方法，涉及基因缺失株研究技术领域。本发明包括以下步骤：1将C50336在LBA中培养至其OD600nm达到0.6‑0.8；2超纯水洗涤3次，将细胞重悬于10％无菌甘油中，以制备感受态细胞；3以pKD3质粒为模板，使用特异性引物P1、P2扩增同源打靶片段；4将纯化的同源打靶片段电转到C50336感受态细胞中；5将培养物涂布含有氯霉素的LB琼脂上，使用特异性引物P3、P4鉴定生长的菌落；6将阳性菌株加热去除pKD46质粒，命名为ΔmcpC::cat；7将pCP20质粒电转到ΔmcpC::cat中，将培养物涂布于LBA琼脂上，并使用步骤5所述特异性引物P3、P4鉴定突变株；8将阳性菌株加热去除pCP20质粒，命名为ΔmcpC。与C50336相比，ΔmcpC的毒力降低。

主权项：1.肠炎沙门菌mcpC基因缺失株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1将携带pKD46质粒的C50336在含有225mgmLL-阿拉伯糖的LBA中于30℃培养，直至其OD600nm达到0.6-0.8；2用预冷的高压灭菌超纯水洗涤3次，将细胞重悬于10％无菌甘油中，以制备感受态细胞；3以pKD3质粒为模板，使用特异性引物P1、P2扩增同源打靶片段；P1：5’-AGCAGCTCATGTTACTGGATGAAGAGGGGCGCTGGAGCCAGAGTTCGCAGAAAGAGCTGTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，如SEQIDNo.1所示；P2：5’-CGCACGCGCCGCTTCAACCGCCGCGTTCAGCGCCAGAATATTGGTCTGAAAGGCAATGGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’，如SEQIDNo.2所示；4将纯化的同源打靶片段电转到C50336pKD46感受态细胞中，加入1mLLB液体培养基并在30℃下孵育2h；5将培养物涂布含有50μgmL氯霉素的LB琼脂上，使用特异性引物P3、P4鉴定生长的菌落；P3：CGCTCTGTCTTTGTTTAGCCTTGA，如SEQIDNo.3所示；P4：ATCCCTTCCTGAGTCTGACTGGTT，如SEQIDNo.4所示；6将阳性菌株在42℃加热6h下去除pKD46质粒，命名为ΔmcpC::cat；7将pCP20质粒电转到ΔmcpC::cat中，加入1mLLB液体培养基并在30℃下孵育2h，将培养物涂布于LBA琼脂上，并使用步骤5所述特异性引物P3、P4鉴定突变株；8将阳性菌株在42℃加热7h下去除pCP20质粒，命名为ΔmcpC。

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