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申请/专利权人：华中农业大学

摘要：本发明公开一种用于治疗杜氏肌营养不良症的生物矿化纳米材料及基因编辑系统，该生物矿化纳米材料，按体积份数计包括如下组分：碳酸盐1份，可溶性钙盐2～5份，高分子包被材料0.5份，缓冲液18～20份；其中，所述碳酸盐包括但不限于Na2CO3和K2CO3；所述可溶性钙盐包括但不限于CaCl2；所述高分子包被材料包括但不限于PVP和PAA；所述缓冲液的pH=7～8，且其中不含碳酸根；该生物矿化纳米材料可以高效地搭载CRISPRCas9质粒，且可保护质粒在血清中免受降解，实现在细胞内及生物体内基因编辑。本发明基因编辑系统为采用所述生物矿化纳米材料为基础载体搭载CRISPRCas9质粒系统用于治疗杜氏肌营养不良症，具有广阔的应用前景及医疗价值。

主权项：1.一种用于治疗杜氏肌营养不良症的基因编辑系统，其特征在于：该基因编辑系统为采用生物矿化纳米材料作为基础载体搭载CRISPRCas9质粒系统；所述生物矿化纳米材料，按体积份数计包括如下组分：碳酸盐1份，可溶性钙盐2～5份，高分子包被材料0.5份，缓冲液18～20份；其中，所述碳酸盐为Na2CO3或K2CO3；所述可溶性钙盐为CaCl2；所述高分子包被材料为PVP或PAA；所述缓冲液不含碳酸根；所述碳酸盐的浓度为40～200mM；所述可溶性钙盐的浓度为180～460mM；所述高分子包被材料的浓度为1M；所述缓冲液的pH=8.0，其含有50mMTris-HCl、300mMNaCl和20%的甘油；该基因编辑系统具体的搭载及矿化过程包括如下步骤：1）质粒准备：将设计的CRISPRCas9质粒系统与鱼精蛋白共孵育，形成待被搭载的目标质粒；所述CRISPRCas9质粒系统为CRISPR变体无PAM限制基因编辑系统，其用于破坏Dys基因的51号外显子；该CRISPRCas9质粒系统的靶序列为SEQ51-1～SEQ51-4中的任意一种：SEQ51-1：CACCAGAGCTAACACTCTGAGTAG，SEQ51-2：TCACCAGAGCTAACACTCTGAGTA，SEQ51-3：GTGGTCTCATTGTCAGACTCATC，SEQ51-4：AGTGGTCTCATTGTCAGACTCAT；2）搭载矿化：将准备好的目标质粒与碳酸盐溶液混合均匀后再加入到缓冲液中混合均匀，然后加入可溶性钙盐，并进行快速涡旋混合，得到搭载目标质粒的矿化纳米颗粒悬浮液；3）细胞跨膜肽吸附：搭载矿化后，将细胞跨膜肽溶液逐滴滴加至得到的矿化纳米颗粒悬浮液中，并于室温下磁力搅拌10min，以将细胞跨膜肽吸附于矿化纳米颗粒的表面，然后进行高分子包被；所述细胞跨膜肽为来源于HIV病毒的细胞跨膜肽TAT，其序列为RKKRRQRRR；4）高分子包被：向得到的矿化纳米颗粒悬浮液中加入高分子包被材料，并静置使高分子材料包被在矿化的纳米颗粒上；5）离心沉淀：将高分子包被后的矿化纳米颗粒悬浮液进行离心，获得搭载目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物；6）分散重悬：将离心得到的搭载了目标质粒的矿化纳米颗粒沉淀物用DMEM或超纯水分散重悬，获得所需浓度的生物矿化纳米颗粒重悬液以用于基因编辑或用于制备预防及治疗杜氏肌营养不良症的药物。

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