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申请/专利权人：江苏省中国科学院植物研究所;江苏大学

摘要：本发明涉及一种球形核酸底物增强的CRISPR‑Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法。检测方法包括：（1）构建环状球形核酸底物；（2）将环结构球形核酸、引导RNA、LbCas12a效应蛋白配置成预混反应液：（3）将待测基因片段与预混反应液混合，孵育反应;（4）读取荧光信号，判定阳性阴性信号；（5）加入显色液，与对照色卡进行比对。本方法利用环结构球形核酸有效增强了LbCas12a效应蛋白与底物的亲和力，提升CRISPR‑Cas12a信号放大能力，避免额外引入核酸扩增步骤从而引起的交叉污染、操作复杂、反应时间长的问题，同时还将荧光和比色相结合，进一步拓宽了该方法针对非洲猪瘟病毒的临场检测能力。

主权项：1.一种非诊断目的的环结构球形核酸底物增强的CRISPR-Cas12a系统检测非洲猪瘟的方法，其特征在于，包括：步骤（1），环结构球形核酸底物的合成；所述环结构球形核酸底物包括链霉亲和素化磁珠、生物素标记的RNAG4单链、FAM荧光基团及BHQ1黑洞淬灭基团标记的单链DNA和合成缓冲溶液，并于室温反应合成，所述FAM荧光基团及BHQ1黑洞淬灭基团标记的单链DNA包括环状结构核酸Loop#5T+2A、Loop#5A+2A或Loop#5C+2A，所述环状结构核酸Loop#5T+2A、Loop#5A+2A和Loop#5C+2A的核苷酸序列依次分别如SEQIDNO:1-3所示；其中，Loop#5T+2A第9位碱基T、Loop#5A+2A第9位碱基T、Loop#5C+2A第9位碱基T，均为6-FAM荧光素修饰的胸腺嘧啶T-残基，Loop#5T+2A第17位碱基T、Loop#5A+2A第17位碱基T、Loop#5C+2A第17位碱基T，均为BHQ1黑洞淬灭基团修饰的胸腺嘧啶T-残基；步骤（2），将上述环状结构球形核酸底物与LbCas12a效应蛋白、引导RNA、反应缓存液混合，配置成预混反应液；步骤（3），将包含目标核酸的待测物与上述预混反应液混合，并孵育反应；步骤（4），完成孵育后读取反应单元中的荧光强度，判定阳性阴性信号；步骤（5），在上述反应单元中继续加入四甲基联苯胺显色液和氯化血红素后，读取比色信号，判定阳性阴性信号；步骤（1）所述的FAM荧光基团及BHQ1黑洞淬灭基团标记的单链DNA应与生物素标记的RNAG4单链碱基互补配对并形成单链状态的环状突起结构；步骤（1）所述的链霉亲和素化磁珠浓度为0.5-4mgmL，生物素标记的RNAG4单链浓度为600-1000nM、FAM荧光基团及BHQ1黑洞淬灭基团标记的单链DNA浓度为400-1600nM；步骤（1）所述生物素标记的RNAG4单链序列如SEQIDNO:4所示；步骤（2）所述引导RNA根据非洲猪瘟病毒B646L的识别位点1、识别位点2、识别位点3，设计的全新引导RNA，包括引导RNA1、引导RNA2、引导RNA3，所述引导RNA1、引导RNA2、引导RNA3的序列如SEQIDNO:5-7所示。

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