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申请/专利权人：青岛科技大学

摘要：本发明属于酶活力测定方法领域，针对现有的蛋白酶活力测定技术存在的灵敏度低，酶浓度曲线不过原点的问题，本发明提供一种蛋白酶活力的测定方法：配制酪蛋白溶液，取用酪蛋白溶液上清液为溶剂配制的不同浓度的色氨酸或牛血清白蛋白标准溶液，在碱性条件下加入新鲜配制的MBTH试剂，加入酸性铁试剂，进行显色反应，测定吸光度值，根据每组色氨酸或牛血清白蛋白浓度与测得的吸光度值之间的关系并绘制标准对应关系曲线；取用酪蛋白溶液，加入蛋白酶，进行酶解反应，并测定吸光度值，计算蛋白酶酶活力。与现有技术的紫外法和Lowrry法相比该方法更灵敏、更准确，显色产物更加稳定。

主权项：1.一种蛋白酶活力的测定方法，其特征在于，具体包括以下步骤：1配制酪蛋白上清液和蛋白酶溶液：a.用碱性溶液将酪蛋白溶解，调pH值至待测pH值，再用待测pH值的缓冲液定容，得到酪蛋白溶液Ⅰ，此酪蛋白溶液Ⅰ适用于测定碱性蛋白酶和中性蛋白酶活力；用碱性溶液将酪蛋白溶解，再将溶解的酪蛋白溶液逐滴加入到缓冲液的共轭酸溶液中并剧烈搅拌，调pH值至待测pH值，再用待测pH值的缓冲液定容，得到酪蛋白溶液Ⅰ，此酪蛋白溶液Ⅰ适用于测定酸性蛋白酶活力；用同一所述待测pH值的缓冲液配制相应的蛋白酶溶液；所述的碱性溶液为NaOH溶液、KOH溶液或所述缓冲液中的共轭碱溶液；b.将步骤a的酪蛋白溶液Ⅰ用所述待测pH值的缓冲液稀释，得酪蛋白溶液Ⅱ，再加入三氯乙酸溶液，离心或过滤，得到酪蛋白上清液；2绘制标准物质的吸光度值与标准物质浓度的标准对应关系曲线：①用步骤b的酪蛋白上清液为溶剂，配制一系列浓度梯度的标准物质溶液，得到含相同酪蛋白浓度的标准物质溶液，所采用的标准物质为色氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、牛血清白蛋白、谷氨酸中的任意一种；②向步骤①的标准物质溶液中，加入碱性试剂，混匀，加入新鲜配制的MBTH溶液，体系中OH-浓度范围为0.01-0.2molL，MBTH的初始浓度范围为0.3-4.5mmolL，在50-100℃条件下反应5-180min；再加入酸性铁试剂，反应体系变成酸性，体系中H+的浓度范围为0.02-0.3molL，Fe3+的初始浓度范围为1-6mmolL，发生显色反应，显色稳定后在580-680nm波长下测定吸光度值，根据每组标准物质浓度与测得的吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；所述的MBTH溶液是由MBTH配制而成的水溶液；所述酸性铁试剂是由可溶性Fe3+盐和强酸配制而成的水溶液；3向步骤a中的酪蛋白溶液Ⅰ中加入蛋白酶溶液，保证所得溶液中酪蛋白浓度与步骤b中酪蛋白溶液Ⅱ中酪蛋白浓度相同，进行酶解反应得到酶解液，在酶解液中加入三氯乙酸溶液以终止酶解反应，充分混匀，离心或过滤，得到酪蛋白酶解液的上清液，该上清液中三氯乙酸的浓度与酪蛋白溶液Ⅱ中三氯乙酸的浓度相同；4制备酶解空白溶液的上清液；5根据步骤②的方法分别测定酶解液和酶解空白溶液的上清液，从而根据步骤2的标准曲线计算得到单位时间内酶解产生的低聚肽浓度，进而得到蛋白酶活力。

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百度查询： 青岛科技大学 一种蛋白酶活力的测定方法