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申请/专利权人：星童医疗技术(苏州)有限公司

摘要：本发明公开了用于放大信号的生物探针包被方法，其中包括将氨基化后的Ficoll400与交联剂Ⅰ反应并还原巯基，将目标抗体经交联剂Ⅱ修饰后与已活化的Ficoll400复合物反应，加入NEM封闭，形成包被液。引入的聚合物Ficoll400，其与抗体形成的树状接枝结构，极大提高探针表面的抗体载量，显著提升生物探针的检测灵敏度。本方案中交联剂Ⅱ与抗体的氨基反应，抗体的氨基暴露在外可直接参与反应，因此该反应可直接适用于所有抗体，无需另外对抗体进行化学修饰使巯基暴露。

主权项：1.用于放大信号的生物探针包被方法，其特征在于：包括以下步骤：对Ficoll400进行预处理，使其被氨基化；（1）将氨基化后的Ficoll400与交联剂Ⅰ反应，并将反应后的液体用还原剂还原巯基；（2）目标抗体与交联剂Ⅱ混合，并通过目标抗体中的氨基与交联剂Ⅱ反应；（3）将步骤（2）所得液体与步骤（3）所得液体进行偶联反应，反应完全后加入NEM封闭，形成包被液；（4）对探针进行APTS气相沉积修饰，并将修饰后的探针用步骤（4）所制备的包被液包被300秒-1800秒后烘干，制得生物探针；其中，所述交联剂Ⅰ为胺和巯基反应性的异双功能交联剂，所述交联剂Ⅱ为带有聚乙二醇的SMCC衍生双功能交联剂；所述交联剂Ⅰ为SPDP，所述交联剂Ⅱ为SMPEG8、SMPEG12、SMPEG24中的一种；步骤（1）包括以下步骤：（1.1）高碘酸钠与Ficoll400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；（1.2）将步骤（1.1）所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；（1.3）用硼氢化钠终止步骤（1.2）中的反应后，用脱盐柱纯化；步骤（1.1）中，高碘酸钠与Ficoll400的摩尔比为1000:1，混合后室温避光静置30分钟，乙二胺与Ficoll400的摩尔比为50万:1，加入乙二醇溶液后室温避光静置30分钟；步骤（1.2）中，乙二胺与Ficoll400的摩尔比为50万:1；步骤（1.3）中，硼氢化钠与Ficoll400的摩尔比为1.0万—5.0万:1；所述还原剂为DTT，所述DTT的工作浓度要求为25mmolL；还包括所述脱盐柱的预制备，包括如下步骤：（a）取9支脱盐离心柱，分别编号1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，其中，编号为1#、2#、3#、4#、5#的脱盐离心柱的规格为5ml，编号为6#、7#、8#、9#的脱盐离心柱的规格为10ml，掰断柱子尾部并松开盖子，将柱子置于收集管中；（b）每支脱盐离心柱均采用1000×g离心2分钟，去除储存液，并在压实树脂倾斜顶端的管壁上做标记，之后所有的离心步骤中将柱子标记处朝外放入离心机；（c）向1#、2#、3#、4#、5#中缓慢加入5次2.5mlPBS碳酸盐缓冲液，前4次加入PBS碳酸盐缓冲液后均采用1000×g离心2分钟去除PBS碳酸盐缓冲液，第5次加入PBS碳酸盐缓冲液后，拧紧盖子，静置备用；（d）向6#、7#、8#、9#中缓慢加入5次5mlPBS，前4次加入PBS后均采用1000×g离心2分钟去除PBS，第5次加入PBS后，拧紧盖子，静置备用；其中，步骤（c）中，1#、2#柱加入碳酸盐缓冲液，3#、4#、5#柱加入PBS；所述步骤（1）包括以下步骤：（1.1）高碘酸钠与Ficoll400均匀混合后，用乙二醇溶液终止反应后再用脱盐柱纯化；（1.1.1）取1mlFicoll400溶液，加入50μlNaIO4溶液后充分混匀，室温避光静置30分钟；（1.1.2）取50μl乙二醇溶液加入上述反应液中，室温避光静置30分钟；（1.1.3）取1#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.1.2）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；（1.2）将步骤（1.1）所得产物与过量乙二胺反应，用脱盐柱纯化；（1.2.1）在步骤（1.1.3）收集的滤液中加入0.92ml乙二胺溶液，充分混匀后室温避光反应3小时；（1.2.2）取2#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.2.1）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液；（1.3）用硼氢化钠终止步骤（1.2）中的反应后，用脱盐柱纯化；（1.3.1）在步骤（1.2.2）收集的滤液中加入100μl硼氢化钠溶液，充分混匀后4℃避光反应2小时；（1.3.2）取3#柱，1000×g离心2分钟后弃滤液，加入步骤（1.3.1）所得溶液，1000×g离心2分钟后收集滤液，制得氨基化后的Ficoll400。

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