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申请/专利权人：中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所;中国农业大学

摘要：本发明公开了一种大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌同步检测试剂盒及检测方法，属于食源性病原菌检测技术领域。本发明将LAMP反应与HCR反应结合，设计出一种双重信号放大以同时检测E.coliO157:H7和SalmonellaTyphimurium的方法和试剂盒。为了实现LAMP产物基础上的二次信号放大，设计了LAMP产物的特异性捕获探针和对应的HCR引物，以提高反应的灵敏度和特异性。将HCR反应固定在链霉亲和素磁珠表面反应，最终的检测信号通过采集磁珠表面的荧光强度实现，从而实现了信号的富集，提高灵敏度。本发明可以直接对污染食品进行检测而无需预增菌步骤，有效缩短反应时间。

主权项：1.一种大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌的同步检测试方法，其特征在于：包括以下步骤：S1：对待测基质中的细菌DNA进行提取；所述基质为食品基质；S2：制备HCR发夹结构及反应缓冲液：将针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的HCR引物、HCR荧光基团修饰引物及HCR生物素修饰引物于95℃加热5分钟后冷却至室温，以形成发夹结构的HCR引物、HCR荧光基团修饰引物和HCR生物素修饰引物；配制PBST缓冲液作为HCR反应缓冲液，pH7.4；S3：制备捕获磁珠：配制用于磁珠清洗的缓冲液Washingbuffer；配制用于磁珠与探针偶联的缓冲液Bingingbuffer；采用Washingbuffer清洗链霉亲和素磁珠SA-MB，并加入Bindingbuffer混匀；将步骤S2中制备的发夹结构的HCR生物素修饰引物加入到上述处理后的SA-MB中，37℃孵育1h，使引物上的生物素与SA-MB定向结合；反应结束后对磁珠采用Washingbuffer进行清洗，并采用Bingingbuffer重悬；分别制成可以捕获大肠杆菌标志性基因LAMP扩增产物的磁珠和可以捕获伤寒沙门氏菌标志性基因LAMP扩增产物的磁珠；S4：LAMP扩增，第一次信号放大：LAMP的反应体系包括：LAMPMasterMix、针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志基因的LAMP引物、提取的细菌DNA模板和无菌去离子水，65℃反应60min；获得反应好的LAMP扩增产物；同时制备LAMP的空白对照：将所述LAMP的反应体系中的细菌DNA模板替换为等体积的无菌去离子水；65℃反应60min；S5：LAMP-HCR反应：向S4中制备的反应好的LAMP扩增产物及空白对照中分别加入针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的LAMP扩增产物捕获探针，混合均匀后于95℃加热5min，冷却到室温后，依次加入S3中制备好的可以捕获大肠杆菌标志性基因LAMP扩增产物的磁珠和可以捕获伤寒沙门氏菌标志性基因LAMP扩增产物的磁珠、S2中制备的发夹结构的HCR引物和HCR荧光基团修饰引物及HCR反应缓冲液，37℃反应30min，然后冷却到室温；通过磁性分离对磁珠进行清洗，用HCR反应缓冲液将磁珠重悬，加入到孔板中，利用酶标仪读取荧光信号并去除孔板自带的荧光；S6：通过读取的荧光信号对待测基质中大肠杆菌和伤寒沙门氏菌进行定性或定量检测;所述大肠杆菌标志性基因为基因Z3276，所述伤寒沙门氏菌标志性基因为基因invA；S2中：针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的HCR引物为Z3276-H1和invA-H1；针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的HCR荧光基团修饰引物为Z3276-FAM-H2和InvA-VIC-H2；针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的HCR生物素修饰引物为Z3276-bio-H1和invA-bio-H1；S4中：针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的LAMP引物为：Z3276-F3、Z3276-B3、Z3276-FIP、Z3276-BIP、invA-F3、invA-B3、invA-FIP和invA-BIP；S5中：针对大肠杆菌标志性基因和伤寒沙门氏菌标志性基因的LAMP扩增产物捕获探针为：Z-LFMB、Z-LBcMB、A-LFMB和A-LBcMB；Z3276-F3的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；Z3276-B3的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；Z3276-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；Z3276-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；invA-F3的核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；invA-B3的核苷酸序列如SEQIDNO.6所示；invA-FIP的核苷酸序列如SEQIDNO.7所示；invA-BIP的核苷酸序列如SEQIDNO.8所示；Z3276-H1的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；Z3276-bio-H1的核苷酸序列如SEQIDNO.10所示；Z3276-FAM-H2的核苷酸序列如SEQIDNO.11所示；invA-H1的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示；invA-bio-H1的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示；InvA-VIC-H2的核苷酸序列如SEQIDNO.14所示；Z-LFMB的核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；Z-LBcMB的核苷酸序列如SEQIDNO.16所示；A-LFMB的核苷酸序列如SEQIDNO.17所示；A-LBcMB的核苷酸序列如SEQIDNO.18所示;S3的具体操作为：S31：配制Washingbuffer：10mMtris-HCl，1mMEDTA，0.01%Tween-20，pH7.4；S32：配制Bingingbuffer：10mMtris-HCl，1mMEDTA，1MNaCl，0.05%Tween-20，pH7.4，用于磁珠分别与Z3276-bio-H1和invA-bio-H1偶联；S33：链霉亲和素磁珠SA-MB进行清洗：取一定体积的SA-MB于离心管中，待磁珠完全被吸附后，吸去上清液并吸取等体积Washingbuffer加入到离心管中，对磁珠进行涡旋震荡，然后磁性分离1-2min，待磁珠完全被吸附后再次吸去上清液，重复2次清洗步骤，最后加入等体积的Bindingbuffer，涡旋混匀；S34：分别吸取等浓度等体积的Z3276-bio-H1和invA-bio-H1，然后分别加入到9倍体积的S33处理后的磁珠中，37℃孵育1h，使bio-H1探针上的生物素与SA-MB定向结合，反应结束后对磁珠进行2次清洗，最后用10倍体积的Bindingbuffer将制备好的捕获磁珠重悬，分别制成可以捕获z3276基因LAMP扩增产物和invA基因LAMP扩增产物的磁珠。

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百度查询： 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 中国农业大学 大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌同步检测试剂盒及检测方法