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申请/专利权人：中国食品药品检定研究院;兰州生物技术开发有限公司

摘要：本公开涉及一种梭状芽胞杆菌神经毒素效价检测方法。所述检测方法利用细胞学检测方法进行，所述检测方法包括：以诱导分化的前脑神经元细胞为基础，使梭状芽胞杆菌神经毒素对所述前脑神经元细胞内的SNARE蛋白进行切割，完成切割后，采用AlphaLISA方法计算SNARE蛋白被切割的比例，确定所述梭状芽胞杆菌神经毒素的效价。本公开提供的检测方法获得的检测结果与小鼠法结果较为接近，可完美替代小鼠法。

主权项：1.一种梭状芽胞杆菌神经毒素效价检测方法，其特征在于，所述检测方法利用细胞学检测方法进行，所述检测方法包括：以诱导分化的前脑神经元细胞为基础，1分别制备至少三个浓度的待测梭状芽胞杆菌神经毒素溶液，2将待测梭状芽胞杆菌神经毒素溶液与含有诱导分化的前脑神经元细胞的溶液混合共孵育，使梭状芽胞杆菌神经毒素对所述前脑神经元细胞内的SNAP25蛋白进行切割，3完成共孵育后，利用细胞裂解液裂解前脑神经元细胞，所述裂解液中含有SNAP25FL和SNAP25197，4对完成裂解的前脑神经元细胞裂解液进行间接AlphaLISA检测或直接AlphaLISA检测，计算SNAP25蛋白被切割的比例，并利用标准曲线确定所述梭状芽胞杆菌神经毒素的效价；所述诱导分化的前脑神经元细胞为HiPSCs诱导分化的前脑神经元细胞，包括γ-氨基丁酸神经元细胞和谷氨酸神经元细胞；所述诱导分化的前脑神经元细胞的制备方法包括：HiPSCs细胞培养、拟胚体生成、神经玫瑰花环选择、前脑神经元分化和成熟；所述神经玫瑰花环选择的方法包括：拟胚体悬浮液加入PLOLaminin包被的细胞培养板孔中孵育7-9天，观察拟胚体出现神经玫瑰花环后，利用DMEMF-12清洗细胞培养板；然后添加神经花环选择试剂孵育1-1.5h后，舍弃选择试剂，并利用DMEMF-12冲洗拟胚体；获得的细胞悬浮液离心取沉淀，并与神经诱导培养基混合重悬，接种至PLOLaminin包被的细胞培养板；所述分化和成熟的方法包括：神经玫瑰花环选择后得到的重悬液利用前脑神经元分化试剂进行分化，所述分化时间为7-9天；分化结束后利用前脑神经元成熟试剂进行成熟，所述成熟的时间为8-9天，得到诱导分化并成熟的前脑神经元细胞；所述间接AlphaLISA检测的方法包括：前脑神经元细胞裂解液、SNAP25FL和生物素化的SNAP25197混合共孵育1-3h；孵育完成后依次加入抗兔IgGAlphaLISA受体微珠37℃孵育1-3h，链霉亲和素偶联的AlphaLISA供体微珠孵育1-3h；孵育完成后，检测溶液的光学信号；所述前脑神经元细胞裂解液、SNAP25FL和生物素化的SNAP25197的体积比为3:1-3:1-3；所述前脑神经元细胞裂解液、抗兔IgGAlphaLISA受体微珠和链霉亲和素偶联的AlphaLISA供体微珠的体积比为6:2-3:2-3；所述直接AlphaLISA检测的方法包括：生物素化的SNAP25197抗体、AlphaLISA受体微珠偶联的SNAP25FL抗体与前脑神经元细胞裂解液共孵育1-3h；然后加入链霉亲和素偶联的AlphaLISA供体微珠共孵育1-3h；孵育完成后，检测溶液的光学信号；所述生物素化的SNAP25197抗体、AlphaLISA受体微珠偶联的SNAP25FL抗体、前脑神经元细胞裂解液的体积比为1-3:1-3:3；所述前脑神经元细胞裂解液和所述链霉亲和素偶联的AlphaLISA供体微珠的体积比为6:4-6；所述梭状芽胞杆菌神经毒素为A型肉毒杆菌神经毒素。

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