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申请/专利权人：连云港市农业科学院

摘要：一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，该方法将木糖标记基因xylA构建到pDR5:RUBY表达载体上，以白花油茶未成熟胚为外植体材料进行遗传转化，一方面利用木糖代替潮霉素筛选，避免潮霉素对外植体的毒害作用；另一方面，利用RUBY进行红色显示标记进行原位观察，不用进行取样或试剂处理，有效规避了无菌材料被污染的风险，同时也减少外植体的损伤。最后，在遗传转化过程中添加适量的纳米硅，可以缓解外植体褐化以及激素沉积，促进愈伤组织的诱导增殖以及植株再生。

主权项：1.一种油茶遗传转化易于获得阳性愈伤并快速鉴定的方法，其特征在于：一．植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建1.1载体材料（1）pDR5:RUBY植物载体：细菌抗性为卡那霉素，植物抗性为潮霉素抗性；（2）pGEM-T-xylA载体；1.2植物表达载体pDR5:RUBY-xylA构建及重组载体鉴定用XhoI酶分别酶切pDR5:RUBY和pGEM-T-xylA，回收pDR5:RUBY载体大片段和pGEM-T-xylA的小片段，T4DNA连接酶16℃过夜连接大小片段；形成pDR5:RUBY-xylA的重组区域，具体为xylA替换pDR5:RUBY载体中潮霉素抗性基因；由于hptII基因两端酶切位点均为XhoI，扩增xylA基因的上下游引物引入了XhoI酶切位点，因此xylA可能以正反两种方向插入到载体上；重组载体鉴定时首先用XhoI酶切验证xylA基因的插入，在有xylA基因的插入的情况下：在pDR5:RUBY载体CaMV35Spromoter末尾端设计的一条上游引物F2：5’-GATGTGATATCTCCACTGACG-3’，在CaMV35SpolyA初始端设计一条下游引物R2：5’-AGCTTGTCGATCGACAGATC-3’，xylA基因片段正向插入时可扩增出预期1532bp的条带，反向插入则无条带，有正向插入的命名为：pDR5:RUBY-xylA，pDR5:RUBY-xylA转化农杆菌EHA105及PCR检测取-80℃保存的EHA105感受态于冰上自然融化，每100μl感受态细胞加入1μlpDR5:RUBY-xylA质粒DNA，移液枪轻轻混匀，依次于冰上5min、液氮5min、37℃水浴5min、冰浴5min，加入1mlLB无抗生素液体培养基于28℃，180rpm震荡培养2~3h；6000rpm离心1min收菌，留取100μl上清轻轻吹打混匀菌块，于超净工作台涂布于含20mgLRif和50mgLKan的LB平板上，倒置放于28℃培养箱2~3d；挑取单克隆菌落于5ml含20mgLRif和50mgLKan的LB液体培养基中28℃，180rpm震荡培养24~36h；提取菌液质粒，设计一对引物扩增RUBY全长序列，其中上游引物RUBY-F:5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R:5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’；扩增出RUBY的CDS区域3939bp，说明pDR5:RUBY-xylA质粒成功转化至农杆菌EHA105；二.外植体选择及消毒材料选择选择白花油茶未成熟果实作为外植体试验材料，采集时间每年8月下旬至9月初，果皮呈青绿色，种胚浅黄色，种皮质地软易去除，内部种胚乳白色；2.2消毒选择发育良好的未成熟果实，洗涤剂搓洗表面灰尘，自来水反复冲洗至无泡沫，流水冲洗30min，置于干净的培养瓶中；进行消毒：三.白花油茶遗传转化3.1pDR5:RUBY-xylA菌液培养及外植体侵染在含50mgLRif和50mgLKan的LB固体培养基上活化含有pDR5:RUBY-xylA载体的EHA105菌株，28℃培养24~48h；挑取单菌落于100ml含有20mgLRif和50mgLKan的LB液体培养基180rpm摇菌培养；待OD600为0.4~0.6时取菌液50ml，室温5000rpm离心10min，弃废液，用200mlMS液体培养基重悬备用；超净工作台中，将消毒后无菌的种胚切成2~4份置于重悬液中轻轻摇动，侵染5min，无菌水清洗3~5次，无菌滤纸吸干转接至共培养基中，28℃黑暗条件下共培养1~2d；3.2胚性愈伤组织诱导共培养结束后，培养基中若有多余农杆菌生长，外植体用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干后转接至胚性愈伤诱导培养中进行选择培养；共培养中若无多余农杆菌生长则直接将外植体转接至选择培养基中；培养温度25℃，光照强度2500~3000lx；每15d继代1次，期间观察胚性愈伤组织出现和生长情况；胚性愈伤组织诱导过程为：外植体刚接种呈乳白色，培养10d后由白色转变成乳黄色，切口边缘开始隆起，说明愈伤组织诱导开始启动；再经过15d后，外植体蓬大生长，质地水润，呈乳黄色至浅绿色；接种50d后，胚性愈伤组织逐渐增多，整体呈浅绿色至绿色，表面覆浅红色，中间夹杂红色；3.3胚状体诱导及不定芽产生培养60d的胚性愈伤组织再经1次继代培养后，体积逐渐膨大；将愈伤组织转接至胚状体诱导培养基中培养15d，愈伤组织表面及其周围产生大量浅绿色至绿色体细胞胚，部分夹杂红色组织，体细胞胚呈球形、心型、鱼雷状和子叶状，且多种相互重叠生长；胚状体诱导30d，伴随体细胞胚的膨大，红色组织逐渐增多；将其转接至不定芽分化培养基中15~20d后诱导体细胞产生不定芽；3.4阳性愈伤检测超净工作台中，将胚性愈伤体细胞胚以及不定芽显示红色的部位用干净手术刀片轻轻切下，绿色组织为对照；液氮研磨后分别提取RNA，反转录成cDNA，利用上游引物RUBY-F:5’-ATGGATCATGCGACCCTCGC-3’；下游引物RUBY-R:5’-TCACTATCACTGGAGGCTTG-3’进行PCR扩增，胚性愈伤、体细胞以及不定芽红色组织中均能扩增出RUBY基因条带，而绿色组织无条带；步骤3.1中所述培养基组分为：MS+0.5mgL2,4-D+2.0mgL6-BA+20mgL纳米硅，其中MS培养基中添加蔗糖30gL，琼脂6.5gL，灭菌前调pH至5.8，121℃高温高压灭菌20min；步骤3.2中所述胚性愈伤组织诱导的选择培养基组分为：MS+0.5mgL2,4-D+2.0mgL6-BA+20mgLnSiO2；MS培养基为25gL木糖+5gL蔗糖，其中还添加100mlL椰汁、100mgLGln、100mgLPro，琼脂7.5gL；培养基灭菌前调pH至5.8，121℃高温高压灭菌20min；步骤3.3中所述胚状体诱导培养基组分为：MS+0.2mgLNAA+1.0mgL6-BA+20mgLnSiO2；不定芽分化培养基组分为：MS+0.5mgLNAA+2.25mgL6-BA+20mgLnSiO2；其中MS培养基为25gL木糖+5gL蔗糖，其中还添加100mlL椰汁、100mgLGln、100mgLPro，琼脂7.5gL；培养基灭菌前调pH至5.8，121℃高温高压灭菌20min。

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