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申请/专利权人：北京彩真细胞技术服务有限责任公司

摘要：本发明公开了一种LUCAT1工程化间充质干细胞的制备方法及其在缺血性肾损伤中的应用。细胞计数试剂盒‑8CCK‑8检测、集落形成和流式细胞术表明，LUCAT1修饰的间充质干细胞上清在经RSL3处理的人近端肾小管上皮细胞HK2中促进细胞增殖，抑制细胞铁死亡。动物体内研究结果表明，LUCAT1修饰的间充质干细胞对缺血性肾损伤有显著的保护作用。本发明的结果表明，LUCAT1修饰的间充质干细胞抑制细胞增殖，抗脂质氧化，保护因缺血引起的肾脏损伤，可能是一种很有前景的肾损伤治疗方法。

主权项：1.一种LUCAT1工程化间充质干细胞的制备方法，其特征在于：步骤1：细胞培养人近端肾小管上皮细胞系HK-2细胞在DMEM含10％胎牛血清中培养，间充质干细胞MSC细胞在MSC专用培养基中培养；步骤2：LUCAT1修饰的工程化干细胞的制备2.1腺病毒的扩增a.培养HEK293细胞在15cm培养皿中生长至80％融合度时，换为无血清的DMEM高糖培养基，加入0.5mLLUCAT1病毒原液对照病毒原液；b.感染48h后，用无菌细胞刮收集上清和细胞；c.取0.5mL细胞悬液，3000rpm离心10min收集细胞，提取RNA，通过Real-timeRT-PCR鉴定LUCAT1表达水平；d.其余细胞悬液反复冻融三次，3000rpm，4℃离心15min，收集上清，标记为病毒一级种子，-80℃保存；e.培养并扩增HEK293细胞，待细胞融合度80％时，换液为无血清培养基，每皿加入0.2mLLUCAT1病毒对照病毒的一级种子；f.感染48h后，用无菌细胞刮收集细胞及上清，3000rpm，4℃离心10min，倒掉上清，加1×PBS以重悬细胞至终体积为6mL；g.细胞悬液反复冻融三次，3000rpm，4℃离心15min，收集上清，标记为病毒二级种子，保存于-80℃；2.2腺病毒的纯化LUCAT1病毒的二级种子使用CsCl密度梯度离心法纯化a.准备工作：配制CsCl密度梯度溶液；称取120gCsCl溶解至1×PBS中，补足至170mL，于超净台中经0.22μm滤器过滤除菌，标记为A液；取A液60mL，加入24mL1×PBS，标记为B液；取A液44mL，加入36mL1×PBS，标记为C液；b.病毒加样：向每只超速离心管中加入2.5mLB液，然后吸取0.5mLA液，将其加至离心管底部；最后往B液上缓慢加入2.5mLC液；往C液上方缓慢加入病毒液，加至距离管口约0.3cm。每管中可加约5mL病毒裂解上清；c.密度梯度离心分层：将超速离心管放进超离机内，35000rpm，4℃离心70min；离心结束后取出液体分层的超速离心管，小心吸取离心后下层白色条带，转移至新的超速离心管中，向离心管中补加B液和A液至管口1cm左右，混匀，补加C液0.5mL左右；d.纯化：再次使用超速离心机，35000rpm，4℃离心4h；用1mL注射器将下层病毒条带吸出后，用1×PBS进行适量稀释并转移到3-12mL的透析袋中，置于2L的1×PBS于4℃进行透析，并分别间隔0.5h、1h、1.5h、2h进行1×PBS的更换，最后过夜透析；透析结束后，将病毒液收集到无菌小瓶中，加入PBS稀释，加入90％甘油使其终体积为10％，混匀后分装，-80℃保存；2.3腺病毒的滴度测定培养HEK293细胞，以1×104细胞孔接种96孔板，每孔培养体系为100μL高糖DMEM+10％FBS；24h后加待测病毒，病毒稀释倍数从105到1012，病毒稀释液为无血清DMEM；10d后显微镜观察每个稀释倍数下出现噬斑的孔的个数；计算方法：如果10-a浓度梯度完全病变，10-a+1浓度梯度病变X个孔，那么计算公式为：N＝1+a+X10-0.5；由此计算出感染滴度＝10N+1IUmL；2.4LUCAT1修饰MSC将MSC以1×105细胞孔的密度接种于6孔板中，待细胞贴壁生长至60％融合度时，随机分成2组，标记为MSC和LUCAT1-MSC，分别加入上述步骤扩增得到的对照腺病毒和LUCAT1腺病毒感染MSC，设置病毒复感染指数为0、25、50、100、150、200，加入对应体积的LUCAT1病毒，8h后换液为完全培养基；48h后使用荧光显微镜观察细胞生长状态和GFP表达情况；从结果中筛选MSC细胞状态良好，GFP表达高亮的组别。

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