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申请/专利权人：奥辰生物(云南)有限公司

摘要：本发明公开了一种人脐带高活性间充质干细胞及其制备方法和应用。用含5%CloneR的TeSR‑E8以及LN521‑Coated培养瓶，从人脐带组织中分离出HA‑MSC，建立HA‑MSC分离、扩增、冻存技术体系。比起其它分离方式，更加简单易行，组织离体后到进入培养箱的时间较短，很大程度上保持了细胞活性。建立的原代培养方式使组织内原始细胞或多能性强的细胞从原代就分选出来，并能稳定的传代和保存，为后续的扩增提供了先决条件。本发明制备的HA‑MSC与常规培养的MSC相比，增殖活性较高，体积较小，核质比较高，高表达胚胎干细胞相关标志性抗原SOX2、Nanog、OCT4，具有向三胚层来源的神经、心肌和肝肠祖细胞分化的潜能。

主权项：1.一种人脐带高活性间充质干细胞MSC的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、试剂制备S11、高活性MSC完全培养基的配制：在TeSR-E8BasalMedium中加入TeSR-E8Supplement，颠倒混匀后再加入CloneR，用6.6%NaHCO3调节pH值范围在7.2-7.4，4℃储存备用；S12、高活性MSC培养瓶的制作：2-8℃缓慢解冻层粘连蛋白LN521原液，用1×DPBS（Ca2+Mg2+）稀释层粘连蛋白LN521原液，即为包被液，培养瓶中加入包被液，使之均匀覆盖整个瓶底，置于2-8℃孵育备用；S2、原代培养；S21、将采集的人脐带清洗去掉残留的血液；S22、将脐带分解为小组织块，转移至高活性MSC培养瓶中；S23、高活性MSC培养瓶加入高活性MSC完全培养基，缓慢晃动瓶身，置于37℃、5%CO2的培养箱中进行原代培养；S24、第3天补充高活性MSC完全培养基，之后每隔3-4天换液；S25、传代时，收集脱落组织块，按照以上方式可以进行二次贴壁培养；S3、传代培养；S31、从培养箱取出细胞，丢弃陈旧培养基，加入生理盐水轻轻冲洗1次；S32、原代高活性MSC加入RecombinantTrypsin-EDTASolution，置于37℃、5%CO2的培养箱中作用3-5mins；S33、细胞完全脱落后，加入等量高活性MSC完全培养基终止消化，收集细胞加入生理盐水，1500rpm离心4mins；S34、离心后弃上清，加入高活性MSC完全培养基，轻轻吹打混匀细胞，台盼蓝染色计数活细胞数量；S35、按照5000个细胞cm2的接种密度将细胞接种至新的高活性MSC培养瓶；S36、置于37℃、5%CO2的培养箱中进行扩增培养；S4、高活性MSC的冻存。

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