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申请/专利权人：无锡市疾病预防控制中心
摘要：本发明涉及一种高效的、利用蔗糖反向筛选系统制备基因改造后的单增李斯特菌的方法，所述方法，包括以下步骤：1单增李斯特菌改造基因或者目标敲除基因的上下同源臂片段的制备；2制备穿梭质粒；3制备重组单增李斯特菌；4第三次反向筛选；得到稳定遗传的基因改造后的单增李斯特菌。
主权项：1.一种高效的、利用蔗糖反向筛选系统制备基因改造后的单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述方法，包括以下步骤：1单增李斯特菌改造基因或者目标敲除基因的上下同源臂片段的制备：提取单增李斯特菌基因组，使用PCR方法获得改造基因或者目标敲除基因的上下游同源臂片段，并进行扩增，得到改造基因或者目标敲除基因的上下同源臂片段；2制备穿梭质粒：用改造基因或者目标敲除基因的上下同源臂片段与pSET4S-p23sacB质粒连接，制备pSET4S-p23sacB重组质粒，将其转化到感受态大肠杆菌中，用壮观霉素和选择性筛选标记进行首次压力筛选，挑取转化成功的大肠杆菌单菌落，经过6-18小时培养，提取出pSET4S-p23sacB重组质粒，每5mL菌液，获取3000ng质粒，即穿梭质粒；3制备重组单增李斯特菌：将穿梭质粒电转到感受态单增李斯特菌中，用壮观霉素和选择性筛选标记，挑取发生单菌落进行单交换的单菌落并对其进行传代培养，此步骤为二次筛选，经过1天培养，得到重组单增李斯特菌；4第三次反向筛选：对二次筛选得到的重组单增李斯特菌单菌落进行高温培养，使质粒丢失，进一步利用温度、蔗糖培养基和选择性筛选标记抗性给于压力实现同源重组，得到稳定遗传的基因改造后的单增李斯特菌。
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权利要求：
百度查询： 无锡市疾病预防控制中心 一种高效的、利用蔗糖反向筛选系统制备基因改造后的单增李斯特菌的方法
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