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申请/专利权人：吉林省农业科学院

摘要：本发明提供了一种dCAPS标记区分异交率大豆雄性不育系的方法，用于鉴定大豆细胞质雄性不育系异交率的高或者低，将为拓宽大豆CMS种质资源和鉴别高异交率和低异交率不育系提供方便快捷的途径。从高异交率的不育系和低异交率不育系中发现存在的差异SNP，在跨SNP的区域侧翼序列设计引物进行PCR扩增，扩增的产物片段大小通过限制性内切酶酶切可以将高异交率的雄性不育系和低异交率不育系区分出来，条带清晰，重复性好，可靠性强，这种应用基于SNP和内切酶结合的标记可以鉴定出育种过程中高异交率的不育系，为制种过程中高效的选择母本，降低制种成本提供保障。

主权项：1.一种dCAPS标记区分高、低异交率大豆雄性不育系的方法，其步骤如下：1）提取RN型细胞质雄性不育系组织的基因组DNA，此DNA作为PCR扩增模板，设计检测所述dCAPS标记的引物，引物序列如下：上游引物序列为：5’-ACAGCGACAAAGTAATGGGTCAAGCT-3’；下游引物序列为：5’-TCTCCAAGATTGACGACGAAGG-3’；2）进行PCR扩增，体系为25μL，其中2×PCRMIX12.5μL，10μMμL的上下游引物各1μL，10～20ngμL的模板DNA4μL，无菌去离子水6.5μL；PCR循环条件为94℃预变性3min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，35个循环；72℃延伸5min；用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，成像并记录条带大小；此PCR产物作为酶切模板；3）进行PCR产物酶切：检测所述dCAPS标记的酶切体系为20μL，其中加入1μL的HindIII；加入1μL的10倍CutSmartbuffer，PCR产物5μL，加入3μLddH2O；酶切反应程序为37℃孵育15min，然后80℃孵育20min将酶失活；4）利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物：琼脂糖凝胶电泳过程：将酶切产物10μL混入2μL的10×溴酚蓝上样缓冲液，然后在配制浓度为2%的琼脂糖凝胶电泳，100V电压，电泳时间为40min；在凝胶成像仪上记录并分析电泳结果；成像并记录条带数量和大小；通过获得不同数量和长度大小的条带进行大豆RN型细胞质雄性不育系的异交率高、低的区分；高异交率不育系的酶切片段长度为302bp，低异交率不育系的酶切片段为三个，长度分别为302bp、279bp和23bp；其中23bp因为分子量小，在琼脂糖凝胶电泳中肉眼观测不出来，能在琼脂糖凝胶电泳上被肉眼观察到的片段为两个，分别是302bp和279bp。

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