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申请/专利权人：青岛大学附属医院

摘要：本发明公开了具有增强过氧化物酶活的双金属纳米酶的制备及应用，包括以下步骤：S1、称取材料制备ZnFeNPs；S2、观察ZnFeNPs形貌特征、酶活特征；S3、对ZnFeNPs进行抗菌性能测试；S4、ZnFeNPs体外生物相容性细胞模型的建立；S5、ZnFeNPs浸提液制备及体外生物相容性评价包括细胞活性检测；S6、ZnFeNPs对体外感染根管模型的生物膜清除评估，模型建立；S7、ZnFeNPs对体外感染根管模型的实验分组，生物膜清除评估。本发明与现有技术相比的优点在于：本发明便于对牙髓、根尖周炎症的控制，并改善微环境促进炎症愈合，有利于牙齿的根管治疗。

主权项：1.具有增强过氧化物酶活的双金属纳米酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、称取0.3063g的5-ASA5-氨基水杨酸、0.3244g的FeCl3、0.2726g的ZnAc·2H2O溶于30mL超纯水中，充分混匀，转移至反应釜中，置入恒温烘箱中高温高压反应12h，无水乙醇、超纯水交叉洗涤各3次，冷冻干燥72h；S2、通过透射电子显微镜TEM和场发射扫描电子显微镜SEM来进行观察ZnFeNPs的形貌特征和分散程度,同时进行样品的元素分布分析，拍摄元素分布图像，通过傅里叶红外光谱仪，获取了ZnFeNPs的傅里叶红外光谱FTIR，确定特征基团，利用X射线光电子能谱仪，对这些样品的X射线光电子能谱XPS和表面元素组成进行分析，并使用ThermoAdvantage软件对Fe的2p、Zn的2p、O1s和C1s的高分辨率光谱进行分峰，粉末X射线衍射XRD用于获取ZnFeNPs的纳米衍射图，以深入研究其晶体结构，最后，采用纳米粒度和Zeta电位分析仪仪器对样品进行Zeta电位分析，探究其表面电荷性质，分别利用TMB和TA测试POD酶活、在不同材料浓度、时间、温度条件下的POD酶活以及不同pH条件下的POD酶活、不同浓度的H2O2TMB条件下POD酶动力学检测；S3、对ZnFeNPs进行抗菌性能测试：细菌培养、ZnFeNPs对游离粪肠球菌的抗菌作用、ZnFeNPs对粪肠球菌生物膜的破坏作用、细菌胞内ROS水平、细菌胞内GSH含量的变化以及细菌形貌观察；S4、ZnFeNPs体外生物相容性细胞模型的建立：先体外提取原代人牙龈成纤维细胞：将切取的牙龈迅速放入生理盐水中，4h内在超净台中用含20％青霉素-链霉素-两性霉素混合液的PBS反复清洗，待完全无杂质洗出后，2mgmL的中性蛋白酶Dispase酶4℃过夜消化，去除上皮组织；无菌刀片切割牙龈组织至约1mm2，3mgmLI型胶原酶，37℃消化40min，将处理后的组织重悬于含有10％FBS的α-MEM完全培养基的T25细胞培养瓶，37℃,5％CO2培养，静置7-10天后，可见长梭形、成纤维样细胞从组织块周围爬出，当细胞爬出并覆盖约80％的瓶底时，开始细胞传代，最终实验选择3-5代细胞，选择第4代细胞，以2×106细胞孔接种于6孔板，待其贴壁后，4％多聚甲醛固定细胞，使用抗波形丝蛋白、抗角蛋白特异蛋白抗体进行免疫荧光染色，并在倒置荧光显微镜下观察细胞形态及特异性抗体荧光显色；S5、ZnFeNPs浸提液制备及体外生物相容性评价包括细胞活性检测：称取5mg的ZnFeNPs在紫外线灯下照射24h后，将ZnFeNPs溶于含有10％FBS的α-MEM完全培养基中，超声溶解半小时，浸泡24h，制备得到ZnFeNPs浸提液，用0.22pm无菌过滤器过滤后存于15mL无菌离心管，4℃冰箱备用保存期不超过7天配制所需溶液：ZnFeNPs终浓度为：20μgmL、40μgmL、60μgmL、80μgmL、100μgmL；H2O2终浓度为200μM；在96孔板中接种HGFs细胞悬液，100μL孔，每孔约4×103个细胞，细胞铺板后置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养24h；待细胞贴壁后，吸除旧培养基，每组分别加入100μL不同浓度的ZnFeNPs浸提液，每组设置6个复孔，以加入常规培养基不加ZnFeNPs浸提液的有细胞孔作为对照组，以加入常规培养基不加ZnFeNPs浸提液的无细胞孔作为空白组，置于37℃，5％CO2的细胞培养箱中培养12h，36h；ZnFeNPs浸提液与HGFs细胞共培养结束后，吸出每孔中的旧培养液，所有细胞使用PBS洗涤1次，然后每孔加入100μL的α-MEM完全培养基和10μL的CCK-8液；按说明书在细胞培养箱中避光孵育3h后，酶标仪450nm处测定OD值，并计算HGFs细胞存活率；S6、ZnFeNPs对体外感染根管模型的生物膜清除评估，模型建立：收集新鲜拔除的离体牛前牙4-6岁保存于PBS中，4℃冰箱储存，选择符合纳入标准的牛牙进行下一步实验，去除样本牙牙根表面的软组织、结石后，设定根管标准长度WL＝20mmWL＝解剖性根尖孔-1mm，将样本牙牙冠截除，疏通样本牙根管，NITI锉+EDTA凝胶预备至4锥35号，3％次氯酸钠超声荡洗，根尖孔用流动树脂封闭处理，将样本牙装入含有PBS的2ml的EP管中，并保持直立状态；处理好的样本牙分别存放于2mL的EP管中，通过高温高压蒸汽灭菌121℃，30min，随机选取2个样本牙检测有无杂菌污染，另随机选取2个样本牙劈开后拍SEM观察根管壁玷污层是否去除和牙本质小管开放程度，剩余经灭菌处理后的样本牙于60℃恒温箱内烘干，用无菌纸尖将样本牙根管内的液体拭干后，注入10μL细菌悬液108CFUmL，在EP管内加入1mL无菌BHI培养基和0.5mL粪肠球菌菌悬液，在37℃、CO2培养箱培养21天，培养结束后，吸除每个EP管内的液体，随后注入1.5mL的PBS，使用移液枪轻轻吹打，反复3次，除去残留培养液。随机选取2个样本牙纵向劈开后拍SEM观察根管内细菌粘附情况，3个样本牙取根管内菌液稀释后涂板计数；S7、ZnFeNPs对体外感染根管模型的生物膜清除评估，实验分组及生物膜清除实验：将样本牙随机分为NSA组、3％H2O2B组、3％NaOClC组、ZnFeNPs+H2O2D组4组，每组5个，使用根管侧方冲洗针头进行根管冲洗，冲洗后保留根管内液体，37℃静置60min，共培养结束后，每组使用PBS轻柔冲洗根管1次，随机选择各组3个样本用于细菌稀释涂板计数，剩余2个样本牙劈开后通过SEM观察根冠13、根中13、根尖13三个不同部位的细菌及生物膜清除效果，将25号吸潮纸尖高温高压灭菌后烘干，分别插入每个根管至WL，静置1min取出，放入含1.5ml的PBS中，震荡摇匀，然后每组取20μL均匀涂板，培养24h，对形成的菌落计数，推算各组粪肠球菌的抑制率，将样本牙纵向劈开不接触根管表面，PBS轻柔冲洗样本牙后，将样本牙保存于1.5ml的2％的戊二醛中，4℃冰箱固定24h，然后进行酒精梯度脱水30％、50％、70％、80％、90％、100％、100％，每次10min，真空干燥箱干燥12h。

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