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申请/专利权人：中国计量科学研究院

摘要：本发明公开了一种血清中N末端B型利钠肽前体NT‑proBNP的定值方法，包括如下步骤：1合成NT‑proBNP特征肽段并测定其纯度；2重量法制备肽段工作溶液；3制备加标血清；4血清预处理；5血清净化；6蛋白质酶解；7高效液相色谱‑三重四极杆质谱检测特征肽段；8建立标准曲线定量血清中的NT‑proBNP含量。本发明方法能够在不使用抗体的前提下完成NT‑proBNP的非靶向定量，与传统靶向富集分析方法相比具有更高的分析效率和检测灵敏度，从而提高了定量结果的准确度。由于特征肽段的纯度定值结果可溯源至氨基酸国家有证标准物质，因此本方法得到的血清NT‑proBNP的定值结果同样具备计量学溯源性。

主权项：1.一种血清中N末端B型利钠肽前体NT-proBNP的定值方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）合成NT-proBNP特征肽段并测定其纯度通过固相合成手段获取NT-proBNP特征肽段QE、SE以及同位素标记的L-QE、L-SE；其中，QE氨基酸序列为“NH2-QRNHLQGKLSE-COOH”，SE氨基酸序列为“NH2-SPRPTGVWKSRE-COOH”，分别如SEQIDNO：1-2所示；L-QE氨基酸序列为“NH2-QR*13C6,15N4NHLQGKLSE-COOH”，L-SE氨基酸序列：“NH2-SPR*13C6,15N4PTGVWKSRE-COOH”；采用同位素稀释质谱法或质量平衡法对QE、SE纯度进行定值；（2）重量法制备肽段工作溶液；（3）制备加标血清使用精密天平分别称量QE、SE、L-QE、L-SE工作液和健康人血清样本，随后混合，根据所添加QE、L-QE，SE、L-SE的质量比，将健康血清定义为低标、等标、高标血清；低标血清中QEL-QE或SEL-SE的质量比为0.8，等标血清中QEL-QE或SEL-SE的质量比为1.0，高标血清中QEL-QE或SEL-SE的质量比为1.2；对于待测的高表达NT-proBNP心力衰竭患者血清，同样使用精密天平分别称量L-QE、L-SE工作液及待测血清，随后混合，使得加标后待测血清中NT-proBNP完全酶解后可释放出的QE、SE质量，与加入的L-QE、L-SE质量比为1.0；（4）血清预处理首先配制1%脱氧胆酸钠水溶液，与1mL血清样本等体积混匀后超声5min，随后室温下振荡10min；加入2mL乙腈进行变性沉淀，充分混匀后置于振荡器中10min，最后在15000rpm下离心15min，使用移液器吸取上清后待用；（5）血清净化选取C18固相萃取SPE小柱作为分离介质，安装于SPE装置并压紧、扣紧；通过SPE装置的流量调节阀门控制萃取液流速，选取液体流速为1滴秒；依次向C18固相萃取SPE小柱中添加甲醇、纯水、样品溶液、纯水、含有0.1%FA的50%乙腈，收集50%乙腈馏分，氮气吹干或离心旋干，待用；（6）蛋白质酶解向脱溶剂后的样品中加入尿素水溶液或盐酸胍溶液，置于振荡器中混匀1h；随后加入Glu-c酶溶液，并置于振荡器中振荡反应；反应完成后氮气吹干或离心旋干，待用；（7）高效液相色谱-三重四极杆质谱检测特征肽段首先配制色谱流动相，即水相为含0.1%甲酸的纯水、有机相为含0.1%甲酸的乙腈，使用50μL水相复溶所有样本，并转移至带有内插管的液相样品瓶中；随后，使用粒径≤2.6μm的C18色谱柱对酶解产物进行分离、洗脱，选用三重四极杆质谱作为检测器，在多反应监测MRM模式下对QE、L-QE，SE、L-SE四条肽段进行采集，质谱参数信息如下表所示： ；洗脱梯度具体为： ；（8）建立标准曲线精准定量血清中的NT-proBNP含量首先以低标、等标、高标血清中QE、L-QE天平称量质量比为横坐标、以低标、等标、高标血清中QE、L-QE的质谱峰面积比为纵坐标，建立标准曲线；同样方式建立SE、L-SE标准曲线；随后，根据步骤（7）中高表达血清样本QE、L-QE以及SE、L-SE的质谱峰面积比值，通过标准曲线计算酶解样本中的QE和SE的质量值；最后，根据QE和SE摩尔质量、NT-proBNP摩尔质量，计算高表达血清中原始NT-proBNP含量，从而实现定值。

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