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申请/专利权人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司;浙江理工大学

摘要：本发明公开的是一种分泌抗TrxA蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法及其应用，TrxA蛋白由pET‑32a表达质粒诱导表达纯化所得，将其作为抗原免疫BALBc小鼠，并通过细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株，抗TrxA单克隆抗体杂交瘤细胞株，其能够稳定分泌TrxA单克隆抗体，使用本发明提供的TrxA单克隆抗体可以特异性识别携带TrxA标签的重组蛋白，具有高灵敏度和高准确性。

主权项：1.一种分泌抗TrxA蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤：步骤1制备抗原：原核表达pET-32a空载体以制备TrxA蛋白；步骤2免疫：将TrxA抗原蛋白与弗氏完全佐剂按1:1混匀乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性BALBc小鼠5只，每只小鼠抗原接种剂量为100μg；其中，正常免疫三次，每次间隔两周，除第一次免疫使用弗氏完全佐剂外，其余两次使用弗氏不完全佐剂；加强免疫一次，不使用弗氏佐剂；步骤3免疫血清效价测定：采用间接ELISA法测定免疫血清效价；步骤4加强免疫：取血清效价最高的小鼠，在融合前3天，皮下多点注射100μgTrxA抗原蛋白步骤5杂交瘤的制备：无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株SP20按10：1-5：1的比例混合，1000g室温离心7min，弃上清；步骤6轻弹离心管底部，使沉淀松散，用37℃预热的聚乙二醇缓慢匀速滴加入离心管中，边滴边摇动，37℃水浴中静置1min；步骤7加入37℃预热的RPMI-1640培养液，3min内加入10mL预热的RPMI-1640培养液，整个过程均都是边轻微摇动离心管边滴加液体，将50mL离心管放入37℃水浴锅中静置10min；步骤81000g室温离心5min，弃上清，加入HAT培养液重悬细胞，培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半HAT培养液，连续直至有克隆形成，融合后七天更换HT培养液培养；步骤9间接ELISA法筛选分泌TrxA蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性率，获得获得稳定分泌抗TrxA单克隆抗体细胞株。

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