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申请/专利权人：济南磐升生物技术有限公司

摘要：一种人阴道上皮模型的体外构建方法，该方法采用液下培养和气液面培养两个阶段，使其复层化，形成体外3D模型。在液下培养过程中，使用低浓度的Ca2+（0.7~1.5mM）防止阴道上皮细胞分化；添加维生素D，保证有足够的上皮细胞维持后续气液培养阶段的细胞分化。在气液界面培养阶段，分化培养基中添加全反式维甲酸和17β‑雌二醇，其中全反式维甲酸能够抑制阴道上皮细胞的持续角化，防止过度角化形成角质层。17β‑雌二醇，增强阴道上皮模型的屏障功能。因此，全反式维甲酸和17β‑雌二醇的共同使用可保证阴道上皮模型其上皮层不能分化出成熟的角质层，但仍然具有一定的屏障功能。

主权项：1.一种人阴道上皮模型的体外构建方法，其特征在于，包括以下步骤:步骤一、人外阴表皮样癌细胞系A431细胞准备，具体方法为：取A431细胞，复苏扩增后，使用P42代细胞，用胰酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5.0×105个mL～5.0×106个mL；接种于T75培养瓶中培养，加入细胞培养基1，晃动培养瓶，使细胞分散均匀，置于37℃、5%CO2条件的培养箱培养；步骤二、人阴道上皮模型的液下接种培养，具体方法为：取步骤一得到的对数生长期的A431细胞，用细胞培养基1重悬A431细胞使密度达到200±50万ml；取重悬的A431细胞按照80~120万cm2接种密度接种在Transwell小室内，每个Transwell小室内加入200ul细胞悬液，然后将细胞培养的Transwell小室置于6孔板内，每个6孔板内加入1ml细胞培养基2，室温放置2h，之后Transwell小室外补加3ml细胞培养基2，使Transwell小室内外界面相平，放置37℃、5%CO2条件的培养箱培养1天；然后更换细胞培养基3，继续培养2天，使Transwell小室内部的细胞与细胞之间形成紧密连接；步骤三、人阴道上皮模型的浸没培养：将步骤二中的Transwell小室内外的细胞培养基3弃掉，将6孔板内的培养基更换为分化培养基4，进行浸没式培养，培养1天；步骤四、人阴道上皮模型的气液培养：将步骤三中的Transwell小室内外的培养基弃掉，将Transwell小室放置于无菌小室架上，Transwell小室外的培养基更换为分化培养基4，使液面与Transwell小室内细胞上表面位于同一水平线，开始分化培养；Transwell小室内不添加培养基，更换分化培养基4后，Transwell小室进行气液界面培养5天，每3天更换一次分化培养基4，得到成熟的人阴道上皮模型；步骤四中分化培养基4的组成按照以下方法配制而成：以DMEM为基础培养基，添加胎牛血清0.1~0.3%，牛脑垂体浸提物BPE10~30ugml，胰岛素3~6μgmL，EGF表皮生长因子0.1~0.4ngml，氢化可的松0.05~0.2μgmL，L-谷氨酰胺0.4~2mM，氯化钙0.7~1.5mM，庆大霉素1~1.5%，维生素D10-6~10-9mmolL，全反式维甲酸0.01~0.1umolL，17β-雌二醇10~100nmolL。

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