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申请/专利权人：韩山师范学院

摘要：本发明公开了一种用于抑制水产病原菌的中药组合物，包括以下步骤，步骤一，原料选取；步骤二，药剂浸泡；步骤三，单独煎制；步骤四，离心过滤；步骤五，药物筛选及优化组合；其中上述步骤一中，人工选取色泽鲜明的丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和八角；其中上述步骤二中，人工将丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和八角进行筛分，并将其倒入清水中洗净，随后烘干；将烘干后的丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和八角分别倒入打碎机中进行打碎加工；该发明，采用丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和八角两两混合作为主要药物，且全部采用中药制作，无副作用，不含抗生素，不会导致耐药性细菌的出现，有利于水产养殖业发展。

主权项：1.一种用于抑制水产病原菌的中药组合物，包括以下步骤，步骤一，原料选取；步骤二，药剂浸泡；步骤三，单独煎制；步骤四，离心过滤；步骤五，药物筛选及优化组合；其特征在于：其中上述步骤一中，人工选取色泽鲜明的丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角；其中上述步骤二中，药剂浸泡包括以下步骤：1人工将丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角进行筛分，并将其倒入清水中洗净，随后烘干；2将烘干后的丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角分别倒入打碎机中进行打碎加工，随后倒出使用过滤网进行过滤；3将丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角分别倒入蒸馏水中浸泡，浸泡30-40min；其中上述步骤三中，单独煎制包括以下步骤：1人工将步骤二3中丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角分别倒入锅中，煮沸1-2h，随后过滤收集滤液；2再将滤液倒入煎锅中进行文火煎熬，直至浓缩至原来的二分之一；3关火静置10-20min，直至混合物降温至室温，将冷却后的混合物进行过滤筛分，随后冷却静置备用；其中上述步骤四中，离心过滤包括以下步骤：1将步骤三3中丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角分别倒入离心机中，调节离心机至1200rpm，离心加工10-20min，收集上层滤液；2将滤液使用0.22μm滤膜过滤，将滤液分装，即可得到用于抑制水产病原菌的中药组合物，将其保存在-80℃冷藏室中保存；其中上述步骤五中，药物筛选及优化组合包括以下步骤：1采用圆盘扩散法测定所有中药提取物的抑菌活性；取少量保种菌株接种于LB液体培养基中，并在30℃，150rpm恒温摇床中培养18h；接着，吸取1mL菌液于1.5mL离心管中，6000rpm，离心2min，舍去菌液上清，用无菌生理盐水稀释菌体至1×107CFUmL，取100μL微生物悬浮液涂于LB固体培养基上；随后，在LB固体培养基上放置半径为6mm的灭菌滤纸，并用20μL的中药提取液浸润；将培养皿置于30℃培养24h，随后测定抑菌圈直径；以恩诺沙星，20μL，0.1mgmL为阳性对照，以蒸馏水20μL为阴性对照；所有的分析都进行了三次；计算平均值，进行对比研究，根据抑菌圈直径大小判定其抑菌能力的强弱；2用肉汤微量稀释法测定提取物对被供试菌株的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度；首先，准备12个无菌离心管，在第一个离心管中加入500μL的中药提取物并与1.5mL的LB液体培养基混合；随后，吸取1mL以1∶1依次稀释到第2至第11管，第12管作为空白对照；每管接种20μL菌悬液1×106CFUmL，所有试管30℃孵育24h；孵育后，每个试管中加入5μLMTT溶液，30℃孵育30min；有大量活菌的试管黄色染料会被还原为蓝色，因此将抑制细菌生长且培养基未发生颜色变化的最高药物浓度称为最小抑菌浓度，所有的分析都重复三次；从加入MTT之后无颜色变化的试管中取部分液体培养基涂布于LB营养琼脂板上，30℃培养24h，观察是否有菌落；未长出菌落的试管的药物浓度即为最小杀菌浓度，所有的分析重复三次；3采用微量肉汤棋盘稀释法测定丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角中药组合后的体外抑菌的联用抑菌指数；根据体外抑菌试验结果，选择丁香和罗汉果、或丁香和山茱萸、或丁香和五味子、或丁香和八角体外抑菌效果敏感药物组合按照1∶1的比例进行配比，并测定联用抑菌指数；FIC分数抑制浓度的计算方法如下：ΣFIC＝FICA+FICB，其中FICA为A药联合MIC时A药的MIC，FICB为B药联合MIC时B药的MIC；当FIC≤0.50时，为显著协同作用；当0.50＜FIC≤1.0时，为协同作用；FIC＝1.0时，为相加作用；1.0＜FIC＜2.0时，为无关作用；FIC≥2.0时，为拮抗作用；所有的分析重复三次。

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