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申请/专利权人：常州新米生物科技有限公司;华中农业大学

摘要：本发明属于基因工程和转基因技术领域，具体涉及一种玉米自交系KN5585的转化方法。本发明通过对热激幼胚、幼胚悬浮时间、农杆菌活化培养基、侵染培养基和选择培养基中的草丁膦筛选剂浓度等参数进行优化，将KN5585受体的转化效率从0.53％提高到26.22％。利用本发明提供的方法，可以实现以玉米自交系KN5585为受体的高效遗传转化，从而培育具有特定性状的转基因KN5585玉米品种。

主权项：1.玉米自交系KN5585的遗传转化方法，其特征在于：包括如下步骤：1）将含有草丁膦抗性基因的AGL1或EHA105农杆菌菌株在活化培养基上划线，28℃黑暗培养24h；2）将KN5585玉米自交系授粉后6-15天，玉米幼胚长至0.5-2.0mm时从玉米穗上剥取获得的幼胚浸入悬浮培养基，悬浮浸泡10-30min，完成幼胚收集后移走液体，热激5min，再加入携带含有草丁膦抗性基因的AGL1或EHA105农杆菌的侵染培养基中侵染5min，期间向农杆菌侵染液中吹打空气；所述吹打空气的具体操作方法为：使用一次性滴管或装载200μL或1000μL枪头的移液器，每隔10秒左右向浸泡外植体的农杆菌进行吹打，共吹打3-5次，产生气泡；3）将幼胚移至共培养基上，23℃黑暗培养48-96h；4）将幼胚移至休息培养基上，26-34℃黑暗培养1-2周；5）将幼胚移至选择培养基上培养，选择培养基中含草丁膦诱导抗性愈伤组织；将抗性愈伤组织转移至分化培养基中，25℃，5000lx，光照培养3周，分化形成再生小苗；6）再生小苗在生根培养基上生根后炼苗、移栽，得到转基因玉米；其中，所用到的培养基配方如下：农杆菌活化培养基：D-葡萄糖20gL+MES19.5gL+NaH2PO40.06gL+NH4Cl1gL+MgSO4·7H2O0.3gL+KCl0.15gL+CaCl2·2H2O0.0132gL+FeSO4·7H2O0.0025gL+琼脂15gL；和悬浮培养基：12MS+蔗糖68.5gL+葡萄糖36gL+L-脯氨酸0.115gL；和侵染培养基：12MS+蔗糖68.5gL+葡萄糖36gL+L-脯氨酸0.115gL+乙酰丁香酮200mM+半胱氨酸200mgL；和共培养基：12MS+蔗糖20gL+葡萄糖10gL+脯氨酸0.115gL+盐酸硫胺素0.5mgL+AgNO320mM+L-半胱氨酸200mgL+2,4-D0.5mgL+毒莠定2.2mgL+乙酰丁香酮200mM；和休息培养基：MS+蔗糖30gL+脯氨酸1.38gL+盐酸硫胺素0.5mgL+AgNO320mM+水解酪蛋白0.5gL+2,4-D0.5mgL+毒莠定2.2mgL+特美汀200mgL；和选择培养基：MS+蔗糖30gL+脯氨酸1.38gL+盐酸硫胺素0.5mgL+AgNO320mM+水解酪蛋白0.5gL+2,4-D0.5mgL+毒莠定2.2mgL+特美汀200mgL+草丁膦40mgL；和分化培养基：MS+蔗糖20gL+6-BA0.1mgL+KT1mgL+特美汀200mgL；和生根培养基：MS+蔗糖20gL+MES0.5gL+IBA0.2mgL。

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