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摘要：一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，属于合成生物学技术领域。本发明主要是采用乳液法把三种古细菌的关键分裂蛋白包封到囊泡中，使用蜂毒素在磷脂囊泡表面打孔后，ATP进入囊泡内部，引发CdvC‑ATP酶解聚另外两种蛋白。该方法制备的人造细胞可以利用共聚焦显微镜表征，判断人造细胞的变形程度和膜断裂。该方法可实现由简单蛋白实现子代繁衍，具有重要的生理意义。
主权项：1.一种自主分裂的人造细胞模型的制备方法，其特征在于：所述方法为：步骤一：构建质粒：下载CdvA、CdvB、CdvC三种蛋白的基因序列并重组到载体上，进行质粒合成，载体选择pDEST-17，在SnapGene软件上确定引物序列和酶切位点，保留N端6xHis标签；步骤二：大肠杆菌异源表达与蛋白质提取：利用热激法将步骤一制备的质粒转染进感受态大肠杆菌中，均匀涂布至固体培养基平板上；20小时后挑单菌落于液体培养基中过夜培养；将所得菌液以1：50的体积比加入液体培养基中进行扩大培养，培养至菌液OD600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.5mmol的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG和4mgmlL-阿拉伯糖，并将培养温度调整至25℃诱导10小时；将培养10h的菌液在冷冻离心机中8000rpm4℃离心3min，弃上清液保留沉淀，用PBS缓冲液清洗沉淀并以8000rpm4℃离心3min，重复3次，得到蛋白过表达的大肠杆菌，重悬菌体后破碎，所得破碎菌体再次离心后取上清液利用镍螯合亲和层析柱和尺寸凝胶排阻色谱进行纯化，获得CdvA、CdvB和CdvC三种目的蛋白；步骤三：乳液法制备包封三种蛋白的人造细胞：通过乳液法将10mMCdvA复合物、1mMCdvB复合物、1mMCdvC三种蛋白包封到囊泡中；步骤四：蜂毒素打孔使ATP进入：向步骤三的包封有三种分裂蛋白混合物的磷脂囊泡溶液中加入蜂毒素，使蜂毒素的终浓度为1-2μgmL，放置10min-20min，然后向囊泡溶液中加入ATP，ATP通过蜂毒素孔进入囊泡内部，在ATP的作用，CdvC蛋白行使其功能，驱动人造细胞发生形变。
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百度查询： 哈尔滨工业大学 一种可自主分裂的人造细胞的制备方法
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