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摘要：本发明公开了一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，属于基因检测技术领域，用于人类EGFR基因19del、T790M和L858R多重突变的数字PCR检测，通过数字PCR平台的方法将多重突变检测集中在一张芯片上进行，能精确方便地实现对19del、T790M和L858R各缺失型进行四‑五通道的高灵敏度检测，灵敏度可达0.1％，能够降低成本，减少样本的消耗，提高检测准确度和灵敏度，降低假阳性，尤其对于样本比较稀缺的ctDNA，也方便肿瘤组织等其他样本类型的检测，为非小细胞肺癌的患者提供一定的用药指导。

主权项：1.一种检测人EGFR基因多突变位点的数字PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：10×dPCRBuffer、dPCR酶、EGFR基因检测体系、阳性对照品、阴性对照品、数字PCR芯片、数字PCR用油相A和数字PCR用油相B；所述EGFR基因检测体系包括检测Ex19Del突变的引物、突变探针、通用探针和新型荧光猝灭探针，Ex19del突变的具体基因型为E746-A750del1、E746-A750del2、L747-p753S、E746_S752V和L747_T751del；L858R突变检测的引物、突变探针和通用探针；T790M突变检测的引物、突变探针和通用探针；L858R突变检测的引物如下序列所示：上游引物SEQIDNO:1：AGCATGTCAAGATCACAGATTT；上游引物SEQIDNO:2：cgcagcatgtcaagatcacagat；上游引物SEQIDNO:3：gaaaacaccgcagcatgtcaag；下游引物SEQIDNO:4：CCTCCTTCTGCATGGTATTC；下游引物SEQIDNO:5：TTTGCCTCCTTCTGCATGGT；下游引物SEQIDNO:6：ACTTTGCCTCCTTCTGCATG；探针如下序列所示：突变探针SEQIDNO:7：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAAA-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:8：5’荧光标记-TGGCCCGCCCAA-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:9：5’荧光标记-TGGGCGGGCCAAA-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:10：5’荧光标记-TGGGCGGGCCA-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:11：5’荧光标记-TGGGTGCGGAAGAGAAAG-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:12：5’荧光标记-TGCTGGGTGCGGAAGAG-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:13：5’荧光标记-GTGCGGAAGAGAAAGAATACC-3’猝灭基团；检测Ex19del突变的引物序列如下所示：上游引物SEQIDNO:14：AGTTAAAATTCCCGTCGCT；上游引物SEQIDNO:15：TTAAAATTCCCGTCGCTAT；上游引物SEQIDNO:16：ATCCCAGAAGGTGAGAAAGTT；下游引物SEQIDNO:17：GCCTGAGGTTCAGAGCCAT；下游引物SEQIDNO:18：CAAAGCAGAAACTCACATCG；下游引物SEQIDNO:19：GAGAAAAGGTGGGCCTGAG；检测探针序列如下所示：突变探针del1SEQIDNO:20：5’荧光标记-TCGGAGATGTTTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；突变探针del1SEQIDNO:21：5’荧光标记-ttcggagatgttttgatagcgac-3’猝灭基团；突变探针del1SEQIDNO:22：5’荧光标记-ctttcggagatgttttgatagcg-3’猝灭基团；突变探针del2SEQIDNO:23：5’荧光标记-CGGAGATGTCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；突变探针del2SEQIDNO:24：5’荧光标记-ttcggagatgtcttgatagcgac-3’猝灭基团；突变探针del2SEQIDNO:25：5’荧光标记-gctttcggagatgtcttgatagcg-3’猝灭基团；突变探针del3SEQIDNO:26：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAACCTTGATAGC-3’猝灭基团；突变探针del3SEQIDNO:27：5’荧光标记-gctttcggaAccttgatagcgac-3’猝灭基团；突变探针del3SEQIDNO:28：5’荧光标记-ctttcggaAccttgatagcgacgg-3’猝灭基团；突变探针del4SEQIDNO:29：5’荧光标记-TGGCTTTCGATTCCTTGATAGCG-3’猝灭基团；突变探针del4SEQIDNO:30：5’荧光标记-TTGGCTTTCGATTCCTTGATAGC-3’猝灭基团；突变探针del4SEQIDNO:31：5’荧光标记-ggctttcgattccttgatagcgac-3’猝灭基团；突变探针del5SEQIDNO:32：5’荧光标记-TGGCTTTCGGAGATTCCTTGATAG-3’猝灭基团；突变探针del5SEQIDNO:33：5’荧光标记-ctttcggagattccttgatagcga-3’猝灭基团；突变探针del5SEQIDNO:34：5’荧光标记-CGGAGATTCCTTGATAGCGACG-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:35：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAA-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:36：5’荧光标记-CGAAAGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:37：5’荧光标记-AGCCAACAAGGAAATCCTCG-3’猝灭基团；新型荧光猝灭探针SEQIDNO:38：GCTATCAA；新型荧光猝灭探针SEQIDNO:39：ACATCTCCG；新型荧光猝灭探针SEQIDNO:40：CGAAAGCCA；T790M突变检测的引物序列如下所示：上游引物SEQIDNO:41：TCTGCCTCACCTCCAC；上游引物SEQIDNO:42：ATCTGCCTCACCTCCAC；上游引物SEQIDNO:43：ATCTGCCTCACCTCCA；下游引物SEQIDNO:44：TTGTGTTCCCGGACATAG；下游引物SEQIDNO:45：TTTGTGTTCCCGGACATAG；下游引物SEQIDNO:46：TTTGTGTTCCCGGACATA；检测探针序列如下所示：突变探针SEQIDNO:47：5’荧光标记-CAGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:48：5’荧光标记-AGCTGCATGATGAT-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:49：5’荧光标记-AGCTGCATGATG-3’猝灭基团；突变探针SEQIDNO:50：5’荧光标记-AGCTGCATGATGA-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:51：5’荧光标记-AAGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:52：5’荧光标记-GCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；通用探针SEQIDNO:53：5’荧光标记-AGCTGCGTGATGA-3’猝灭基团；所述数字PCR用油相A包括含氢量0.1％-0.8％的含氢硅油、0.01％-0.5％TritonX-100；所述数字PCR用油相B包括端乙烯基硅油、0.1％的铂催化剂、0.15％的EM90。

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