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摘要：本发明公开一种稳定的原代小胶质细胞分离及培养方法，应用于天麻及其活性成分治疗神经退行性疾病的研究，主要包括小鼠脑组织剥离、组织剪碎与消化、细胞悬液制备与过滤、细胞离心与铺板、换液与纯化、细胞培养与模型建立以及药物处理与评估。本发明提供的原代小胶质细胞分离及培养方法操作简便、效率高，且能够获得分化程度低、纯度高的稳定细胞群；所用试剂和耗材均为常规实验室用品，无需特殊设备或复杂操作技巧，降低了实验成本；该方法不仅适用于天麻及其活性成分等神经保护药物的研究，还可广泛应用于其他神经生物学的研究。

主权项：1.一种稳定的原代小胶质细胞分离及培养方法，应用于天麻及其活性成分治疗神经退行性疾病的研究，其特征在于：包括以下具体步骤：1小鼠脑组织剥离：在显微镜下剥离含有血管的脑膜组织，剥离完成后，用弯镊夹几块皮质或海马放到新的冰上放置的培养皿中；2剪碎组织：将10cm培养皿中的DMEM弃除，轻柔剪碎组织；3消化：加入0.25％胰酶于37℃培养箱消化组织15min，用1-2mL的高糖完全培养基终止消化；4吹打：再向孔中加入1mL高糖完全培养基，吹打组织使其成为细胞悬液；5过滤：将匀浆悬液吸出加入到连接50mL试管的70μm细胞筛收集细胞悬液，使用70μm细胞筛前先用D-PBS缓冲液润湿，弃去滤器，将细胞悬液1000rpm，4℃离心7min；6铺板：彻底移去上清，使用高糖完全培养基重悬细胞沉淀，提前准10mL高糖完全培养基于75cm2培养瓶，将重悬的细胞悬液加入培养瓶中，放入37℃培养箱培养；7换液：24h后全量换液一次；8每隔7-9天使用新鲜高糖完全培养基和以300×g的速度离心的旧培养基的上清液1：1混合液进行半量换液；9细胞培养8-10天左右，细胞明显分层生长，用新鲜高糖完全培养基换液；10在第8天，将旧的培养基从培养瓶转移到50mL离心管中，然后瓶口拧松后放入37℃培养箱中进行培养，随后将新鲜的高糖完全培养基加入培养瓶，使用封口膜密封培养瓶口，将培养瓶放置在37℃摇床上振摇5-6h；收集散落细胞，直接使用新鲜高糖完全培养基和以300×g的速度离心的旧培养基的上清液1：1混合液重悬细胞沉淀并接种至细胞板；11分离纯化的小胶质细胞接种于包被了圆形玻片的细胞板中，待培养24h后进行后续实验；12小胶质细胞分离纯化后，建立神经退行性疾病细胞模型；13不同浓度的天麻及其活性成分对神经退行性疾病细胞进行处理，开发治疗神经退行性疾病的创新药物。

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