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摘要：本发明提供了一种便携式快速可视化烟草花叶病毒纸基分子印迹传感器的构建方法及应用。该传感器以烟草花叶病毒TMV为模板，利用固相印迹得到高特异性的有机荧光纳米凝胶印迹聚合物TMV‑nanoMIPs为信号输出，同时以便宜便携的纸基作为传感芯片，在纸基上印迹TMV，洗脱后得到带有TMV印迹空腔的纸基印迹聚合物WP@MIPs。当WP@MIPs特异性捕获TMV后，TMV‑nanoMIPs也会因为其特异性结合到TMV上，从而形成MIPs‑TMV‑MIPs的夹心结构。通过TMV‑nanoMIPs作为信号探针，本发明实现了对目标病毒TMV的肉眼和紫外灯的快速半定量可视化检测，十分钟即可观察到明显变化，同时它也可以通过荧光分光光度计进行定量检测分析。且在真实受TMV感染的烟叶中具有较好的检测能力，且其成本低至0.623元个。该传感器有望在农作物感染病毒期间实现现场自助式快速可视化检测，对植物病害虫的防控具有重要意义。

主权项：1.一种便携式快速可视化烟草花叶病毒纸基分子印迹传感器的构建与应用，首先，以烟草花叶病毒TMV为模板，利用固相印迹得到具有复合有机荧光染料信号的人工抗体纳米凝胶TMV-nanoMIPs作为信号探针；其次，以纸基为载体材料，在纸基上印迹TMV，洗脱后得到纸基印迹聚合物，由纸基印迹聚合物与荧光比色信号探针TMV-nanoMIPs构建为可用于可视化检测TMV的纸基分子印迹传感器，具体包括如下步骤：步骤1Fe3O4@SiO2的制备：取FeCl3·6H2O5.4g溶于乙二醇160mL中，剧烈搅拌得到澄清溶液，然后加入NaAc14.4g和聚乙二醇4g于50℃下搅拌30min，转移至聚四氟乙烯反应釜中于200℃下反应24h。将产物用乙醇和水洗涤多次，50℃真空下干燥得到Fe3O41.508g。称取500mgFe3O4，加入50mL异丙醇和2mL去离子水中，超声分散30min，在700rpm机械搅拌下加入5mLNH3·H2O和2.5mLTEOS并在45℃下反应6h，得到的产物用磁铁收集，并用乙醇和水洗涤交替洗涤数次后，将其置于50℃下真空干燥过夜得到Fe3O4@SiO2；步骤2Fe3O4@SiO2-NH2的制备：取500mgFe3O4@SiO2粒子，超声30min使其完全分散在80mL无水乙醇超纯水11，vv中。在40℃下加热搅拌5min，然后将2mLAPTES缓慢滴加入烧瓶中，反应12h。反应后的粒子用磁铁聚集于瓶底，倒去上清液，并用超纯水和无水乙醇交替洗涤多次，将洗涤后的颗粒60℃下真空干燥过夜得到Fe3O4@SiO2-NH2粒子；步骤3Fe3O4@TMV的制备：将100mgFe3O4@SiO2-NH2粒子悬浮于含有10mL戊二醛5％，vv中，氩气除氧30min，并在氩气保护下避光37℃搅拌3h，在Fe3O4@SiO2-NH2粒子表面引入醛基得到Fe3O4@CHO，用于后续固定病毒，借助外来磁力收集磁性粒子，用除氧的PBS0.01M,pH＝7.4洗涤3次，除去未反应的戊二醛。然后将收集得到的醛基化粒子分散于除过氧的10mLPBS0.01M,pH＝7.4中，加入100μL0.287nMTMV烟草花叶病毒，在水浴恒温振荡器上孵育2h。然后收集磁性粒子，洗涤除去多余的病毒，分散于10mLPBS0.1M,pH＝7.4中，得到Fe3O4@TMV；步骤4TMV-nanoMIPs的制备：首先，将罗丹明B0.497g，1mmol溶解在4mL超纯水中，再加入1mLEDC0.191g，1mmol和1mLNHS0.029g，0.25mmol，37℃振荡1h，活化罗丹明B上的羧基。将4mLN-3-氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐APMA，0.178g，1mmol加入到上述活化了的罗丹明B中，37℃继续振荡2h。反应结束后，用二氯甲烷萃取两次，之后加水萃取两次，留下有机相，旋转蒸发仪浓缩旋干，用乙腈和水重结晶固体，抽滤后得到荧光染料复合物。将N-异丙基丙烯酰胺NIPAM，7.9mg，70μmol、N-叔丁基丙烯酰胺TBA，3.8mg，30μmol，溶于500μL乙醇、丙烯酸AA，1.73μL，1.1μmol、N-3-氨基丙基甲基丙烯酰胺盐酸盐APMA，0.9mg，6μmol，N,N-亚甲基双丙烯酰胺BIS，2mg，12.97μmol混合于10mL超纯水，并加入荧光复合染料2mg，溶于500μL乙醇于上述混合物中，使用氩气除氧30min，水泵抽真空10分钟。抽真空前，将4mL分散在PBS中的TMV改性的磁性纳米颗粒Fe3O4@TMV使用针头注入到上述烧瓶中，再继续抽真空除氧，然后用封口膜密封烧瓶并用氩气保护，将反应溶液置于恒温振荡器上并振荡30分钟，将1mL过硫酸铵APS，6mg，26μmol和N,N,N’,N’-四甲基乙二胺TEMED，6μL在氮气氛围下注入烧瓶中，将反应溶液置于恒温振荡器上在25℃下振荡12小时。反应结束后，用磁铁收集固体颗粒，并用25℃超纯水冲洗洗涤以除去未反应的功能单体和低亲和力的印迹聚合物，直到上清液中没有荧光。然后，将收集到的磁性粒子分散于2mL超纯水中，并在60℃水浴振荡器振荡60分钟，通过外部磁铁的磁力将磁性固体颗粒与上清液分离，此操作重复两次，获得的4mL的上清液即为可溶性纳米凝胶印迹聚合物TMV-nanoMIPs。于4℃下密封储存。步骤5纸基的改性：取一张70mm×70mm的Whantman1号定性滤纸，将其用大量乙醇冲洗进行活化，50℃真空干燥。然后将200μL三乙胺TEA和50mg4-二甲氨基吡啶DMAP添加到15mL二氯甲烷DCM的玻璃培养皿中，加入200μL三氯乙烯基硅烷TVCs，最后将活化后的纸基加入到上述培养皿中，摇床上室温振荡2小时，最后用乙醇冲洗3次洗去未反应完的单体，50℃真空干燥得到接枝了乙烯基的滤纸WP@C＝C。步骤6纸基印迹聚合物WP@MIPsWP@NIPs的制备：取0.1mmol4-乙烯基吡啶4-VP，0.1mmol丙烯酸锌ZincAA和50μL2.87nM的TMV病毒溶解在20mLDMF中，在37℃下搅拌预聚合两小时。然后再加入0.3mmol乙二醇二甲基丙烯酯EGDMA和4张1.3cm×1.3cm的WP@C＝C，氩气除氧30min，加入20mg引发剂AIBN，最后转移到65℃中聚合12h。聚合完成后，将纸取出用超纯水沉涤除去未及应物，最后用1.0mL洗脱剂甲醇：乙酸＝9：1vv滤纸洗脱4次。再用超纯水多次洗涤直至完全洗去洗脱液，在50℃下真空干燥得到WP@MIPs。WP@NIPs的制备没有添加模板病毒TMV，其它操作与上一致。

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百度查询： 湘潭大学 一种便携式快速可视化烟草花叶病毒纸基分子印迹传感器的构建与应用