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摘要：本发明公开了一种冻存脐带血造血干细胞来源的NK细胞的制备方法，包括以下步骤：（一）脐带血复苏；（二）分离脐带血单个核细胞；（三）NK细胞的诱导制备：向经包被的培养瓶中加入激活培养基，将单个核细胞接种至培养瓶，加入IL‑21、IL‑18、抗凋亡剂、BDNF、NGF、TPO和SDF‑1，置于5%CO2、37℃条件中培养；培养的第3天和第5天补加激活培养基；培养的第7天开始，每2天补加扩增培养基；培养的第17～20天收集细胞，即得NK细胞。本发明的方法在激活时加入多种激活因子，可促使细胞恢复冻存前的状态。利用本发明的方法得到的NK细胞能够分泌大量的细胞因子IFN‑γ，与新鲜脐带血来源的NK细胞无异。
主权项：1.一种冻存脐带血造血干细胞来源的NK细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（一）脐带血复苏：取冻存脐带血，水浴融化，加入37℃的复苏溶液，离心，弃上清，得血样；（二）分离脐带血单个核细胞：使用淋巴细胞分离液分离脐带血单个核细胞，并加入氯化铵溶液裂解红细胞，采用清洗溶液洗涤，得单个核细胞；（三）NK细胞的诱导制备：向经Lymactin-NK包被的培养瓶中加入激活培养基，将单个核细胞接种至培养瓶，加入IL-21、IL-18、抗凋亡剂、BDNF、NGF、TPO和SDF-1，添加后，IL-21、IL-18、抗凋亡剂、BDNF、NGF、TPO和SDF-1的浓度分别为20ngmL、10ngmL、20mM、50μgmL、50μgmL、50μgmL和50μgmL；置于5%CO2、37℃条件中培养；培养的第3天和第5天，补加激活培养基；培养的第7天开始，每2天补加扩增培养基；培养的第17～20天收集细胞，即得NK细胞；所述激活培养基是由KBM581培养基和IL-15组成的，IL-15的浓度为20ngmL；所述扩增培养基是由KBM581培养基和IL-2组成的，IL-2的浓度为1000IUmL。
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