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龙图腾网恭喜合肥工业大学申请的专利促进番茄果实成熟的基因及其调控方法获国家发明授权专利权，本发明授权专利权由国家知识产权局授予，授权公告号为：CN116004648B 。

龙图腾网通过国家知识产权局官网在2025-04-22发布的发明授权授权公告中获悉：该发明授权的专利申请号/专利号为：202210850569.1，技术领域涉及：C12N15/29；该发明授权促进番茄果实成熟的基因及其调控方法是由胡康棣;张华;姚改芳设计研发完成，并于2022-07-20向国家知识产权局提交的专利申请。

本促进番茄果实成熟的基因及其调控方法在说明书摘要公布了：促进番茄果实成熟的基因及其调控方法，所述基因的核苷酸序列如SeqNo.1所示。本发明通过从番茄中得到SlIMP3基因完整的编码序列，设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSRCas9上，利用农杆菌侵染法转化植物，获得基因编辑植株，对基因编辑植株进行了分析，结果表明该基因编辑后能够加速番茄果实成熟。

本发明授权促进番茄果实成熟的基因及其调控方法在权利要求书中公布了：1.一种促进番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将10μL靶点一正向引物-F1、10μL靶点一反向引物-R1、80μLddH2O混匀；再将10μL靶点二正向引物-F2、10μL靶点二反向引物-R2、80μLddH2O混匀；将以上两管引物混合物分别置于PCR仪中，88-92℃条件下处理25-35s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，分别作为靶点一接头和靶点二接头；靶点一正向引物-F1：5’-GTCAGAGGCCAAGTGATAGGACCG-3’；靶点一反向引物-R1：5’-AAACCGGTCCTATCACTTGGCCTC-3’；靶点二正向引物-F2：5’-GTCAGCGGCCTTCGTCGGCATCAA-3’；靶点二反向引物-R2：5’-AAACTTGATGCCGACGAAGGCCGC-3’；步骤2：配制10μL酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点一接头和靶点二接头分别与gRNA表达盒连接，包括：0.5μL靶点一接头，1μLgRNA质粒U3dU3b，1μL10×cutsmartbuffer，0.4μLBsaI，0.1μLT4DNAligase，0.4μLT4DNAligasebuffer，ddH2O补足至10μL；PCR扩增参数为：37℃5min，20℃5min，5个循环，4℃∞；得到靶点一产物；0.5μL靶点二接头，1μLgRNA质粒U3dU3b，1μL10×cutsmartbuffer，0.4μLBsaI，0.1μLT4DNAligase，0.4μLT4DNAligasebuffer，ddH2O补足至10μL；PCR扩增参数为：37℃5min，20℃5min，5个循环，4℃∞；得到靶点二产物；步骤3：第一轮PCR扩增：分别以步骤2得到的靶点一产物和靶点二产物为模板，进行PCR扩增，包括：靶点一反应1体系：1μL靶点一产物，2μL靶点一反向引物-R1，2μL引物U-F，1μLdNTPs，10μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，1μLSuper-FidelityDNAPolymerase，33μLddH2O；PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，25个循环；72℃10min；4℃∞，得到第一产物；引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；靶点二反应1体系：1μL靶点二产物，2μL靶点二反向引物-R2，2μL引物U-F，1μLdNTPs，10μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，1μLSuper-FidelityDNAPolymerase，33μLddH2O；PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，25个循环；72℃10min；4℃∞，得到第二产物；引物U-F：5’-CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG-3’；靶点一反应2体系：1μL靶点一产物，2μL靶点一正向引物-F1，2μL引物gRNA-R，1μLdNTPs，10μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，1μLSuper-FidelityDNAPolymerase，33μLddH2O；PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，25个循环；72℃10min；4℃∞，得到第三产物；引物gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；靶点二反应2体系：1μL靶点二产物，2μL靶点二正向引物-F2，2μL引物gRNA-R，1μLdNTPs，10μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，1μLSuper-FidelityDNAPolymerase，33μLddH2O，PCR条件：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，25个循环；72℃10min；4℃∞，得到第四产物；引物gRNA-R：5’-CGGAGGAAAATTCCATCCAC-3’；步骤4：第二轮扩增：预先将位置特异引物对混合成10×工作液，每种1.5μM：PT1：1.5μL引物B1’+1.5μL引物B2+7μLddH2O；PT2L：1.5μL引物B2’+1.5μL引物BL+7μLddH2O；分别取第一轮PCR扩增的第一产物、第二产物、第三产物和第四产物1μL，用ddH2O稀释10倍，得到第一产物稀释液、第二产物稀释液、第三产物稀释液和第四产物稀释液；第一产物稀释液和第三产物稀释液混合得到第二轮第一模板，第二产物稀释液和第四产物稀释液混合得到第二轮第二模板；2μL第二轮第一模板，3μLPT1，0.6μLdNTPs，6μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，0.6μLSuper-FidelityDNAPolymerase，17.8μLddH2O，PCR体系：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，15-20循环；72℃10min；4℃∞；得到第二轮PCR扩增产物一；2μL第二轮第二模板，3μLPT2L，0.6μLdNTPs，6μL5×Super-FidelityDNAPolymerasebuffer，0.6μLSuper-FidelityDNAPolymerase，17.8μLddH2O，PCR体系：95℃1min；95℃10s，60℃15s，72℃15s，15-20循环；72℃10min；4℃∞；得到第二轮PCR扩增产物二；引物B1’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；引物B2：5’-AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；引物B2’：5’-TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG-3’；引物BL：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC-3’；步骤5：将第二轮PCR扩增产物一和第二轮PCR扩增产物二按浓度比1:1混合，利用DNA产物纯化试剂盒，对混合产物进行纯化，得到纯化后的gRNA表达盒；步骤6：利用边切边连法将步骤5得到的纯化后的gRNA表达盒与Cas9质粒进行连接，得到连接产物；步骤7：通过化学热激法，将步骤6得到的连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取得到重组CrisprCas9-SlIMP3质粒；步骤8：将重组CRISPRCas9-SlIMP3质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞，得到含有CrisprCas9-SlIMP3质粒的EHA105农杆菌；步骤9：利用含有CrisprCas9-SlIMP3质粒的EHA105农杆菌，侵染番茄子叶得到转化的番茄植株。

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