买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：扬州大学

摘要：本发明还提供了一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX‑6p‑1载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如下：上游引物1：5’‑GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC‑3’；下游引物1：5’‑GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT‑3’。该方法简化克隆过程，可快速构建GyV9病毒VP3基因的原核表达载体，实现VP3基因快速克隆表达。本发明获得的GyV9病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV9诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV9流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

主权项：一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列为：上游引物1：5’‑GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC‑3’；下游引物1：5’‑GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT‑3’。

全文数据：一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种GyV9环形病毒VP3蛋白的制备方法。背景技术[0002]鸡传染性贫血病毒ChickenInfectiousAnemiaVirus，CAV-直被认为是圆环病毒科Circoviridae中环形病毒属^Gyrovirus唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等[0003]RijsewijkFA,DosSantosHF,TeixeiraTF,CibulskiSP,VarelaAP,DezenD,etal.DiscoveryofagenomeofadistantrelativeofchickenanemiavirusrevealsanewmemberofthegenusGyrovirus.Archivesofvirology.2011Jun；1566:1097-100从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等（SauvageV，ChevalJ，FoulongneV，GouilhMA，ParienteK,ManuguerraJC,etal.Identificationofthefirsthumangyrovirus,avirusrelatedtochickenanemiavirus.Journalofvirology.201lAug；8515:7948-50在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然目前尚无检测GyV9抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV9病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV9蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV9在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂;并为探究GyV9VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。发明内容[0004]本发明的目的是在于提供一种操作简单、效率高、快速的GyV9环形病毒VP3蛋白表达载体的制备方法，并实现VP3蛋白的表达。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出GyV9病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV9的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案具体如下：[0006]本发明提供了一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其核苷酸序列为：[0007]上游引物1:5'-GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC-3'；[0008]下游引物1:5'-GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT-3'。[0009]本发明还提供了一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-l载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术;并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达;其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如上述所示。[0010]其具体包括如下步骤：[0011]1PCR扩增PGEX-6P-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段：以PGEX-6P-1质粒以及GyV9病毒VP3基因为模板，设计引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段;其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如上述所示;优选地，PCR扩增pGEX-6p-l线性化载体引物的核苷酸序列如下：[0012]上游引物2:5'-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3'；[0013]下游引物2:5'-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3'。[0014]2将GyV9病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-l载体:利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；[0015]3阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。[0016]本发明还提供了上述GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，以及上述的引物在制备GyV9诊断抗原、抗VP3多克隆抗体以及制备GyV9流行病学有效诊断试剂方面的应用。[0017]本发明的技术方案达到了如下的有益效果：[0018]该发明设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，简化克隆过程，可快速构建GyV9病毒VP3基因的原核表达载体，实现VP3基因快速克隆表达。使用本发明的方法，将获得GyV9环形病毒VP3蛋白表达载体，实现VP3基因在大肠杆菌中的表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。本发明获得的GyV9病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV9诊断抗原;作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体;为开展GyV9流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。这一表达载体构建及纯化的VP3融合蛋白将为建立检测GyV9抗原及抗体的血清学诊断方法，探究VP3生物学功能提供有效的免疫学试剂，填补国内外空白。因此，本发明具有一定应用价值。附图说明[0019]图1是一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法策略。步骤1:以人工合成的GyV9病毒VP3基因为模板，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段。步骤2:利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。步骤3:阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。[0020]图2是PCR扩增GyV9病毒VP3片段。泳道l，GyV9病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNAMarker〇[0021]图3是PCR扩增线性化载体pGEX-6p-l。泳道1，线性化载体pGEX-6p-l的PCR产物;泳道M，DNAMarker。[0022]图4是SDS-PAGE分析GyV9病毒VP3基因的表达。泳道1，VP3超声裂解上清；泳道2，VP3超声裂解沉淀;泳道4，纯化的VP3蛋白；泳道5，GST超声裂解上清;泳道6，GST超声裂解沉淀;泳道Μ，蛋白Marker。[0023]图5是Westernblot鉴定抗GyV9VP3蛋白多克隆抗体。1，转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物;2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。具体实施方式[0024]为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。[0025]实施例1[0026]1设计扩增含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段引物：[0027]表1:扩增pGEX-6p_l线性化载体和GyV9病毒VP3片段引物设计：[0028][0029]扩增pGEX-6p-l线性化载体上游引物位于pGEX-6p-l质粒1022-1047位;且在5'端带有额外TAA碱基;扩增pGEX-6p-l线性化载体下游引物位于pGEX-6p-l质粒916-941位;且在5'端带有额外CAT碱基。扩增GyV9病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5'端带有16个与pGEX-6p-l线性化载体下游引物反向互补碱基;扩增GyV9病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5'端带有16个与pGEX-6p_l线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列见附表1，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成。[0030]2PGEX-6P-1线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段PCR扩增：[0031]以pGEX-6p-l质粒以及合成的GyV9VP3基因为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤UPCR扩增反应体系为：40μ1水，5μ110倍缓冲液，ΙμL10mM1ΝΤΡ，1μ1ΙΟμLϋοΙ上游引物，ΙμLΙΟμLϋοΙ下游引物，ΙμLiongμL的pGEX-6p-l质粒或pcGyV9-VP3质粒，ΙμL商品化的PhantaSuper-FidelityDNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为:94°C变性5分钟，随后进行30个循环94°C变性30秒，58°C退火30秒，72°C延伸3分钟），最后72°C延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道Μ为DNAMarker，其中泳道1为GyV9病毒VP3片段PCR产物。如图3所示，其中泳道Μ为DNAMarker，泳道1为线性化载体pGEX-6p-l的PCR产物。[0032]3GyV9病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-l载体：[0033]将以上纯化的表达线性化载体pGEX-6p-l以及GyV9病毒VP3片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMII的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的GyV9病毒VP3片段产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-l表达线性化载体50ng，2yl商品化的ExnaseTMII酶，4μ15倍的缓冲液，其它补加水至20μ1。反应物于37°C作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μ1反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。[0034]实施例2[0035]lGyV9病毒VP3蛋白诱导表达：[0036]将获得的含GyV9病毒VP3基因的阳性克隆（命名为PGEX-VP3转化到BL21细菌后，转接种于3ml含Amp100ygmL的LB液体培养基，37°C250rpm振摇培养过夜。次日按1:100转接种于LB培养基，37°C1500rpm振摇2.5h，用终浓度为ImMIPTG37°C诱导。诱导5h后将菌液转移至离心管内，6000rpm离心5min，去上清，用PBS洗涤一次，600yL灭菌DDW悬浮细菌，并且在冰浴上进行超声波裂解，30HZ，lOmin。lOOOOrpm离心5min，取上清，沉淀用300yL灭菌DDW重悬，-20°C冻存备用。分别取30yL细菌裂解上清和沉淀，加入5yL6XSDS凝胶上样缓冲液混匀，煮沸5min;用于SDS-PAGE5%的浓缩胶，10%的分离胶）电泳分析重组蛋白的表达及其表达形式。在图4中，VP3蛋白可在超声破碎样品上清中以可溶性形式存在。[0037]2GyV9病毒VP3蛋白的纯化：[0038]在确定VP3的可溶性表达基础上，将超声破碎样品上清通过GST纯化柱进行了VP3蛋白的纯化。简要步骤如下：向纯化柱中加入5个体积的DDW去除乙醇；用10个体积的结合Buffer140mMNacl，2.7mMKCl，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04平衡柱子；将蛋白样品5-10mL每次，重复过柱两次，使蛋白充分结合在柱上。用10个体积的结合Buffer洗涤柱中的杂蛋白；用5个体积的洗脱Buffer50mMTris-HCl，10mM还原性谷胱甘肽洗脱目的蛋白，随后加入透析袋中用1XPBS溶液充分透析，分装后，在-70°C保存；取纯化后的蛋白按比例加入5XLoadingBuffer，煮样5min后，用SDS-PAGE电泳分析。结果表明VP3蛋白获得了良好的纯化如图4中泳道4所示）。[0039]3GyV9病毒VP3蛋白的免疫反应性：[0040]将纯化的VP3蛋白腹腔免疫6周龄BALBC小鼠，免疫三次，每次间隔14天，剂量均为5〇yg只次。首免时与等体积的完全弗氏佐剂混合至油包水状，再次免疫时与等体积的不完全弗氏佐剂混合，之后免疫不加佐剂。三免后采集小鼠血清，用在293T细胞中表达的VP3蛋白作为抗原进行westernblot分析血清中抗VP3特异性抗体。结果表明获得的抗GyV9病毒VP3蛋白的小鼠多抗能与在293T细胞中表达的VP3蛋白进行特异性反应（图5。这一结果表明本发明表达的VP3蛋白具有很好的反应性及免疫原性，在GyV9血清学诊断中将具有良好的应用前景。[0041]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

权利要求：1.一种PCR扩增GyV9病毒VP3基因引物，其特征在于，所述的引物的核苷酸序列为：上游引物1:5'-GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC-3'；下游引物1:5'-GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT-3'。2.-种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，其特征在于，所述的方法基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-l载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术;并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达;其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如权利要求1所示。3.如权利要求2所述的一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1.PCR扩增pGEX-6p-l线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段：以pGEX-6p-l质粒以及GyV9病毒VP3基因为模板，设计引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-l线性化载体以及GyV9病毒VP3基因片段;其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如权利要求1所示；2将GyV9病毒VP3片段快速克隆进pGEX-6p-l载体:利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；3阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。4.如权利要求3所述的一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，其特征在于，步骤1中，PCR扩增pGEX-6p-l线性化载体时使用的引物的核苷酸序列如下：上游引物2:5'-TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC-3'；下游引物2:5'-CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT-3'。5.如权利要求1所述的引物，以及权利要求2、3或者4所述的一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，在制备GyV9诊断抗原、抗VP3多克隆抗体以及制备GyV9流行病学有效诊断试剂方面的应用。

百度查询： 扬州大学 一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法