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申请/专利权人：暨南大学

摘要：本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057；在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌Providencia sp.2D；在第10天DBP降解率达65%，相比对照提高了46%；另外添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率达88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将Providenciasp.2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤，对降低农业土壤环境中DBP污染具有广泛的应用前景。

主权项：普罗威登斯菌（Providencia sp.）2D在DBP污染土壤修复中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏编号为CCTCC M 2015057。

全文数据：普罗威登斯菌Provideneiasp.2D在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用技术领域[0001]本发明涉及环境污染物生物处理技术领域，更具体地，涉及普罗威登斯菌Providenciasp.2D在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用。背景技术[0002]邻苯二甲酸二丁酯（di-n_butylphthalate，DBP属于邻苯二甲酸酯类化合物Phthalicacidester，PAEs，是塑料工业最主要的增塑剂之一，也是农药、染料去污剂的载体以及诸多化妆品、纺织品的生产原料，广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械以及儿童玩具等领域。由于上述制品的大量应用，DBP已经成为全球性的有机污染物，广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。特别是在农业生产中，由于塑料薄膜和塑料大棚的广泛应用，残留在农业土壤中DBP极易通过食物链在人体中富集。DBP及其代谢物能够对机体造成生殖毒性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤，因此美国环保署EPA和中国国家环境监测中心CNEMC都已将它列为优先控制污染物。[0003]研究表明，DBP的水解和光解速率都非常缓慢，生物降解是其在环境中分解的主要途径。因此，获得DBP高效降解菌是提高其生物降解效率的重要环节。利用微生物降解作用，将DBP转化为无害物质或完全矿化，是公认的去除环境中DBP污染的最佳手段。由于环境中DBP的普遍存在，DBP降解菌的出现频率也很高，目前对DBP有降解作用的微生物大多数为戈登氏菌属、农杆菌属、不动杆菌属和赤红球菌属等，但已报道的这些细菌对于DBP的生物降解不完全，会产生毒性更高的中间代谢产物，或者其降解速率还不能满足实际污染控制的要求，因此仍需筛选更加高效的专性或兼性降解菌。[0004]在农业生产中，土壤的DBP污染已经得到人们广泛关注。DBP污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选与构建。普罗威登斯菌属Providencia是堆肥中广泛存在的一类细菌，目前尚无关于其降解PAEs的报道。另外，堆肥在改善土壤结构和保护农业生态环境方面具有高效、环保和低成本等优势，结合筛选获得的高效降解菌，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。发明内容[0005]本发明为了克服现有技术的上述不足，提供普罗威登斯菌ProvidenciaspJD在邻苯二甲酸二丁酯污染土壤修复中的应用。[0006]本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：[0007]普罗威登斯菌Providenciasp.2D在DBP污染土壤修复中的应用，所述普罗威登斯菌Providenciasp.2D于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015057,保藏地址为:湖北省武汉市武汉大学。[0008]DBP污染土壤的微生物修复技术中需要解决的首要问题是高效降解菌株的筛选与构建。普罗威登斯菌属Providencia是堆肥中广泛存在的一类细菌，目前尚无关于其降解PAEs的报道。本发明从动物粪堆肥中分离筛选获得一株对DBP具有高效、完全降解性能的普罗威登斯菌，命名为Providenciasp.2D，并发现该菌可有效降低土壤中的DBP污染，是理想的土壤环境污染修复微生物。[0009]所述菌株Providenciasp.2D通过富集培养法从农场动物奠堆肥样品中富集获得，该菌的最适生长条件为:温度30〜40°C，pH为7.0〜8.5。[00Ί0]所述菌株ProvidenciaSP.2D在牛肉膏蛋白胨培养基LI3上酵母粉5.0g，蛋白胨10.Og，氯化钠10.Og，pH=7.0划线培养7天，菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄;扫描电子显微镜下呈长杆状，长约1.5〜3.Ομπι，宽约0.5〜0.8μηι;经革兰氏染色鉴定该菌为革兰氏阴性菌。[0011]所述菌株Providenciasp.2D的生理生化鉴定实验结果如下：甲基红试验（阳性）、V-P试验（阴性）、剛噪反应（阳性）、柠檬酸盐利用（阳性）、肌醇产酸试验（阳性）、葡萄糖产酸试验（阳性）、淀粉水解试验（阴性）、尿酶试验（阳性）、明胶液化试验（阴性）、硝酸盐还原阳性）、氧化酶试验（阴性和葡萄糖产气试验（阴性）。[0012]所述菌株Providenciasp.2D的16SrDNA基因序列如SEQIDNO:1所不，通过NCBI官方网站http:www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16SrDNA序列进行比对，结果表明该菌株与Providenciasp.相似性最高，同源率达99%〇[0013]优选地，上述应用为:在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌Providenciasp.2D，所述普罗威登斯菌Providenciasp.2D的用量为:每200g含100mgkgDBP的污染土壤中添加普罗威登斯菌Providenciasp.2D菌悬液0D6QQnm=0.850mL。[0014]上述普罗威登斯菌Providenciasp.2D降解邻苯二甲酸二丁酯的应用具体为:将普罗威登斯菌Providenciasp.2D活化后制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的土壤中。[0015]作为一种更优选的技术方案，上述应用是将普罗威登斯菌Providenciasp.2D经过过夜活化、震荡培养至对数期，收集菌体，根据实际需要调节菌体含量并制成菌悬液，将制得的菌悬液接入受邻苯二甲酸二丁酯污染的土壤中。[0016]另外，发明人研究还发现在DBP污染土壤中同时添加动物粪堆肥可进一步增强土壤中DBP的降解，因此，本发明所述具体应用的过程中，还可以在DBP污染的土壤中添加动物奠堆肥混勾后再接入普罗威登斯菌Providenciasp.2D;所述动物奠堆肥与DBP污染土壤的质量比为1:15。[0017]本发明还提供普罗威登斯菌Providenciasp.2D在制备DBP污染土壤修复改良剂中的应用。[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0019]本发明提供了普罗威登斯菌Providenciasp.2D在DBP污染土壤修复中的应用，具体是在DBP污染的土壤中接种普罗威登斯菌Providenciasp.2D;接2D菌的土壤在第10天DBP残留量为34.46mgkg，降解率达到了65%，而未接菌的对照土壤DBP降解率仅为19%，相比对照提高了46%;另外，在添加了堆肥并接菌的土壤中，其第十天的DBP降解率达到了88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将Providenciasp.2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤，对降低农业土壤环境中DBP污染具有十分广泛的应用前景。附图说明[0020]图1为Providenciasp.2D在LB培养基上培养7天的生长形态。[0021]图2为Providenciasp.2D的扫描电镜图。[0022]图3为Providenciasp.2D的16SrDNA的系统发育树。[0023]图4为Providencia8口.20对11^和邻苯二甲酸的降解动力学曲线。[0024]图5为Providenciasp·2D对不同土壤处理中DBP的降解效果。具体实施方式[0025]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0026]实施例1邻苯二甲酸二丁酯降解菌的分离与鉴定[0027]1、培养基配方[0028]无机盐培养液（MSM，gL:Κ2ΗΡ04:5·8;ΚΗ2Ρ04:4·5;NH42S〇4:2.0;MgCl2:0.16;CaCl2:0.02;Na2Mo〇4·2H20:0.0024;FeCl3:0.0018;MnCl2·2Η2〇:0·0015;调节无机盐培养液的最终pH为7.5。添加DBP，使其在无机盐培养液中的浓度为50mgL，DBP作为唯一碳源。[0029]牛肉膏蛋白胨培养基LB:酵母粉5.Og，蛋白胨10.Og，氯化钠10.Og，加超纯水至IL，调节pH=7.0。121°C灭菌20分钟。固体平板则添加1.5%WV琼脂粉。[0030]2、分离与鉴定[0031]分离方法采用样品悬液摇瓶法:称取5g堆肥样品（取自农场动物堆肥于含有50mL无菌水的150mL三角瓶中，在30°C，140rpm条件下培养3天后取5mL堆肥悬液加入IOOmL含DBP50mgL的上述MSM培养基中。经30°C，HOrpm下培养7天后，每次按取ImL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高MSM培养基中DBP含量至1000mgL第二次转接，MSM培养基中DBP的含量为100mgL，之后每转接一次，MSM培养基中DBP的含量提高100mgL。然后将转接10次的培养液稀释IO3〜IO5涂布于LB固体平板上，30°C倒置培养1〜3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号为2D。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态。LB平板培养7天的菌落呈橘黄色，质地膏状，丰厚湿润，易被挑起，边缘较薄见图1。[0032]扫描电镜样品制备与观察:将菌种2D的单菌落接入含有IOmL的LB液体培养基过夜活化。吸取800yL菌液经8000rpm离心3〜5min，去上清液，加入500yLPBS洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入ImL2.5%vv戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然后再次经8000rpm离心3〜5min，去上清液，加入500yLPBS洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个梯度约浸泡15min，然后8000rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20min，方法同乙醇脱水。菌体经过CO2干燥后制片观察。扫描电镜下可以观察到该菌呈长杆状，长约1.5〜3.0μηι，宽约0.5〜0.8μηι见图2。[0033]菌株的生理生化鉴定指标包括12项：甲基红试验、V-P试验、吲哚反应、柠檬酸盐利用、肌醇产酸试验、葡萄糖产酸试验、淀粉水解试验、尿酶试验、明胶液化试验、硝酸盐还原、氧化酶试验和葡萄糖产气试验。具体实验结果见表1。[0034]表I2D菌的生理生化特征[0035]+:阳性;阴性[0036]菌株的16SrDNA鉴定:提取细菌总DNA，用细菌16SrDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序（由上海生工完成）后，将测序结果与GenBank中已报道的16SrDNA序列进行同源性比对，并选取若干菌种做进化树分析。如图3所示，本发明分离纯化得到的菌株2D的16SrDNA序列与普罗威登斯菌Providenciastuartii，菌种保藏号为NBRC12930同源率达99%，进化距离最近。与该菌属其他菌种也有较高同源性。因此，本发明筛选获得的菌株鉴定为普罗威登斯菌属，命名为Providenciasp.2D。[0037]实施例2Providenciasp.2D对DBP及其中间产物邻苯二甲酸的降解实验[0038]1、菌悬液制备[0039]将纯化后的菌种Providenciasp.2D接入含有IOmL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000rpm离心IOmin收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节㈤TOQnm=O.8作为菌种悬液。[0040]2、降解能力测定[0041]分别向含有不同浓度DBP50、100、200、500、1000mgL和邻苯二甲酸25、50、100、200、500mgL的MSM培养液（无机盐培养液gL:K2HP〇4:5·8;KH2P〇4:4·5;冊42S〇4:2·0;MgCl2:0.16;CaCl2:0.02;Na2Mo〇4·2H20:0.0024;FeCl3:0.0018;MnCl2·2H20:0.0015中接菌ImL，以不接菌作为对照，并调节pH为8.0，每组三个重复。在30°C，HOrpm恒温摇床培养6天，定期取样，经GCMS测定DBP及邻苯二甲酸的降解情况。[0042]色谱条件:采用岛津公司QP2010Plus型GCMS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5柱子0.25μπιX0.25mmX30m，进样温度为250°C，离子源EI温度为220°C，采用不分流进样1yL，载气为高纯氦气。升温程序为:初始温度为100°C，保持2min，15°Cmin梯度上升至129°C，然后以40°Cmin升温至280°C，保持5min。[0043]质量控制:采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5〜110.2%，相对偏差低于10.5%，仪器检测限为0.12〜0.45ugg。该方法满足痕量有机物定量分析要求。[0044]结果如图4所示:Providenciasp·2D菌在72h对高浓度的DBP1000mgL降解效率超过80%，在DBP浓度低于200mgL时，72h内DBP几乎完全降解，表明该菌对DBP具有高效的降解能力。对DBP中间产物的降解能力分析，可以看出该菌的对高浓度邻苯二甲酸的降解能力显著低于DBP，但对低浓度邻苯二甲酸（彡100mgL降解能力较强（在144h几乎完全降解）；邻苯二甲酸浓度为200mgL时，在144h的降解率超过90%。说明该菌对DBP的主要代谢产物邻苯二甲酸也有较强的降解能力，最终将DBP完全矿化。[0045]实施例3Providenciasp.2D对污染土壤中DBP的降解研究[0046]1、供试土壤制备[0047]土壤为华南农业大学农场水稻土，pH为6.7，CN为5.98，风干后过60目筛。动物粪堆肥采自该农场，pH为8.8，CN为17.49。按照农场常用添加比例（堆肥:土壤=1:15，ww在水稻土中添加堆肥，混匀获得pH=7.54，CN为10.8的改良土。将上述未添加堆肥土常规土和改良土分别添加DBP，使其浓度均达到100mgkg。[0048]1、土壤中DBP降解效果分析[0049]实验设置以下处理:接菌的常规土和改良土作为实验组；不接菌的常规土和改良土作为对照组一；灭过菌的改良土和先灭菌再接2D菌的改良土作为对照组二，每组三个重复。分别称取上述含l〇〇mgkgDBP的土壤200g于三角瓶中，向土壤中添加菌悬液OD6〇〇nm=0.850mL，充分混匀。将土壤调至田间持水量约30%的含水量），在30°C恒温箱中避光培养，定期取样并经GCMS测定土壤中DBP残留量。[0050]经过10天的Providenciasp.2D的生物强化修复处理，各处理中污染土壤DBP残留量动态变化见图5。接2D菌的常规土中DBP降解效果显著增强，在第0、2、4、6、8、10天，土壤中DBP残留量分别为98·41mgkg、88·13mgkg、75·40mgkg、61·25mgkg、44·85mgkg和34.46mgkg，在第10天的降解率达到了65%，而未接菌的对照土壤DBP降解率仅为19%，说明Providenciasp.2D菌能够显著增强土壤中DBP的降解。另外，在添加了堆肥并接菌的改良土中，相对于未添加堆肥的接菌土，DBP的降解效果进一步增强，其第十天的DBP降解率达到了88%，表明堆肥可增强土壤中DBP的降解，将Providenciasp.2D菌与堆肥结合使用，可高效修复DBP污染的土壤。[0051]另外，未灭菌且接种2D菌的改良土中DBP的降解效率显著高于灭过菌且接种2D菌的改良土，说明2D菌与改良土中的土著微生物形成协同作用，促进了土壤中的DBP的降解。

权利要求：1.普罗威登斯菌ft-ovidenciasp.2D在DBP污染土壤修复中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015057〇2.普罗威登斯菌Provicenciasp.2D在制备DBP污染土壤修复改良剂中的应用，其特征在于，该菌于2015年1月22日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2015057〇3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用为将普罗威登斯菌ProWdMCiasp.2D活化后制得的菌悬液接入DBP污染土壤中。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在DBP污染的土壤中添加动物粪堆肥并混勾后再接入普罗威登斯菌ft-ovicenciasp.2D菌悬液。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述动物粪堆肥与DBP污染土壤的质量比为1:15〇

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