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申请/专利权人：浙江师范大学

摘要：本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。黑曲霉（Aspergillus niger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCC M 2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18S rDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。经培养基配方和培养条件优化后，5 L发酵罐发酵116 h，Lovastatin产量可达267.02 mgL。

主权项：黑曲霉（Aspergillus niger）An‑19菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M2015673，保藏日期为：2015年11月11日。

全文数据：黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株及其用于洛伐他汀的生产的用途和发酵方法技术领域本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产Lovastatin的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株、用途和发酵生产方法。背景技术黑曲霉（Aspergillusniger）是在自然界广泛存在的一种丝状真菌，属半知菌门、丝孢纲（Hyphomycetes）、丛梗孢目（Moniliales）、丛梗孢科（Moniliaceae）。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中，生长适宜pH为3~7。是重要的工业发酵菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。也是美国食品药品监督局（FDA）认定的GRAS（GenerallyRegardedAsSafe）菌株之一，在有机酸、工业酶制剂方面应用广泛。此外有些菌株还会产生具有重要应用价值的生理活性物质如Lovastatin等。1980年，Alberts等从土曲霉（Aspergillusterreus）中提取到称为洛伐他汀（Lovastatin）的化合物。Lovastatin是降血脂的他汀类药物，具有抑制体内生物合成胆固醇的关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG）的活性，可用于治疗心血管疾病。美国和日本等国家通过发酵的方式开发出一系列的Lovastatin药物，但我国对降脂曲霉的研究生产中普遍存在产量偏低、生产成本偏高等问题。究其原因主要是缺乏优良的生产菌株和适宜的发酵工艺。因而筛选出高产Lovastatin的曲霉菌株并对其发酵工艺进行优化，具有良好的理论意义和应用前景。本发明所筛选的黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，具有高产Lovastatin、生长速度快、培养方法简单等优良特性。在发酵培养基初始pH为5.5，培养温度为26℃条件下，An-19菌株通过液体发酵培养基和发酵条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mgL。发明内容针对市场上Lovastatin需求日益增长，生产Lovastatin优良工业菌株的缺乏等的问题。本发明的目的是提供1株高产Lovastatin黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株和发酵生产Lovastatin的方法。本发明所述黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，中国武汉大学。保藏日期为：2015年11月11日。黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15d菌落直径达60mm，有环形沟纹；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm~8μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色，球状，直径150μm～350μm；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm。黑曲霉An-19菌株用于产生洛伐他汀（Lovastatin）的应用。黑曲霉An-19菌株的发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。本发明所涉及的An-19菌株筛选自自然发酵的稻谷，经形态特征和18SrDNA基因序列分析，鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger）。经培养基配方和培养条件优化后，5L发酵罐发酵116h，Lovastatin产量可达267.02mgL。高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）用接种针挑少量该菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d；2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h。作为优选，发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。作为优选，发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200rmin，通气量120Lh，罐压0.1MPa~0.5MPa。作为优选，一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。作为优选，二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。作为优选，发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。取上述制得发酵液10mL，加甲醇40mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000rmin离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，可达220mgL~270mgL。黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株5L发酵罐发酵110h~120h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin，与滤液混合；用远藤章教授方法提取Lovastatin，蒸干后得微黄色块状晶体；核磁共振波谱技术分析比对表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致。黑曲霉在食品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，An-19菌株可用于Lovastatin的生产，是较有潜力的工业菌株。附图说明图1An-19菌株PDA培养基上培养15d菌落正面。图2An-19菌株PDA培养基上培养5d分生孢子头生长的显微特征（100X）。图3An-19菌株分生孢子头显微特征（呈球状，200X）。图4An-19菌株分生孢子显微特征（400X）。图5An-19菌株18SrDNA基因序列（1302bp）。图6基于16株曲霉属（Aspergillus）18SrDNA基因序列建立的An-19菌株系统发育树。图7An-19菌株在5L发酵罐中的生长曲线和Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。图8An-19菌株发酵液中Lovastatin提取物外观（10X）。保藏声明黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株，保藏编号为：CCTCCM2015673，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2015年11月11日。具体实施方式下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。实施例1黑曲霉（Aspergillusniger）An-19菌株的筛选和鉴定1培养基①PDA培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、琼脂粉2.0%，水1L，pH5.5~6.0。用于曲霉菌株的分离纯化和鉴定。②PD培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、水1L，pH5.5~6.0。用于高产Lovastatin曲霉菌株的筛选。实验方法2.1曲霉菌株的分离纯化从不同生境收集的自然发酵样品表面挑取少量菌丝接入PDA培养基平板表面，26℃培养24h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养基平板上继续培养3d产生孢子后，显微镜观察具有曲霉的典型特征，挑取少许边缘菌丝纯化3次，得性状均一的曲霉纯菌株。将分离纯化获得的曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4℃冰箱备用。高产Lovastatin曲霉菌株的筛选用高效液相色谱法（HPLC）检测曲霉各菌株发酵液中Lovastatin产量进行筛选。曲霉各保存菌株26℃PDA平板培养3d后，用打孔器取1菌饼（直径0.8mm）转接种于PD培养液中，26℃、200rmin摇床培养7d。取发酵液1mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000rmin离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，利用HPLC法检测Lovastatin产量，筛选高产Lovastatin的曲霉菌株。色谱条件：AgilentPrep-C18液相色谱柱，波长：λ=237nm。菌株的鉴定An-19菌株PDA培养基平板上26℃培养5d，显微镜观察An-19菌株的菌丝、分生孢子头、分生孢子梗、顶囊、分生孢子等的形态特征。提取An-19菌株的基因组DNA，扩增18SrDNA基因序列，送上海生物工程公司测序。根据形态特征和18SrDNA基因序列，参考曲霉属《TheGenusAspergillus》分种检索表，确定分类地位。实验结果3.1曲霉菌株的获得和高产Lovastatin曲霉菌株的筛选通过分离纯化从各地不同生境收集的自然发酵样品（食品、土壤、有机质等）中分离纯化共获得256株曲霉纯菌株。利用高效液相（HPLC）法对256株曲霉纯菌株发酵液进行Lovastatin产量检测，经筛选获1株Lovastatin产量较高的曲霉菌株，编号为An-19菌株，该菌株分离自自然发酵的稻谷。菌株的鉴定结果An-19菌株的形态特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，后变成黑褐色粉粒状，15d菌落直径达60mm，有环形沟纹（附图1）；显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径6μm~8μm的分支状；分生孢子头丰富，黑褐色球状，直径150μm～350μm（附图2）；分生孢子梗茎长短不一，壁较薄，光滑黄褐色；顶囊膨大成球形，双层小梗（附图3）；分生孢子呈褐色球形或近球形，表面粗糙，直径4~5μm×4~4.5μm（附图4）。18SrDNA基因序列分析结果表明，其长度为1302bp（附图5），与黑曲霉（Aspergillusniger）（附图6）。根据An-19菌株的形态特征和18SrDNA基因序列，结合曲霉属（Aspergillus）分种检索表，将An-19菌株鉴定为黑曲霉（Aspergillusniger）。实施例2An-19菌株在5L发酵罐中的生长曲线、Lovastatin的产生和制备1菌株：An-19曲霉菌株。培养基①PDA培养基：配方同实施例1。②PD培养液：配方同实施例1。③一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0。④二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0。⑤发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。实验方法3.1An-19菌株的培养用接种针挑少量An-19菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养3d；取平皿中1菌饼（直径0.8mm）接种于PD培养液中，摇床培养3d，制得一级种子；在种子培养液中，按6%加入一级种子，200rmin摇床培养2d成二级种子；在5L发酵罐中按15%接入二级种子进行发酵培养。发酵培养条件：26℃、pH5.5、转速200rmin，通气量120Lh，罐压0.1MPa~0.5MPa。菌丝干重的测定1.5mL空离心管放于在85℃的烘箱中烘干取出，称取空离心管质量为m；每管吸取1mL培养液，在4℃，10000rmin离心10min，弃上清；加无菌蒸馏水洗3次，10000rmin离心10min，弃上清，放入85℃烘箱中烘至恒重，称取质量为M；菌丝干重质量为M-m。每隔4h取1mLAn-19菌株发酵液测定菌丝干重。以取样时间为横坐标，An-19菌株菌丝干重为纵坐标绘制生长曲线。产量随发酵时间变化曲线分析每隔4h取发酵液1mL，加甲醇4mL（按1:4的比例），超声处理20min，50℃水浴2h，3000rmin离心3min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，HPLC法检测Lovastatin产量，以培养时间为横坐标，An-19菌株的Lovastatin产量为纵坐标，绘制An-19菌株Lovastatin产量随发酵时间变化曲线。发酵液中Lovastatin的分离纯化和鉴定An-19菌株5L发酵罐发酵110h~120h后，过滤发酵液，乙酸乙酯萃取菌丝中Lovastatin成分，与滤液混合；用远藤章教授方法分离纯化Lovastatin，蒸干后得晶体；将晶体样品分别溶于甲醇和氘代氯仿中，核磁共振波谱技术分析鉴定。实验结果4.1An-19菌株的生长曲线每隔4h取样测定菌丝干重，An-19菌株生长曲线见图7。An-19菌株0~20h生长速度慢，为迟缓期；24h~68h快速生长，菌体量大增，为对数生长期；发酵至72h后，长势趋于平缓，菌体量达到最高，为稳定生长期，菌丝干重达260.5gL；104h后出现泡沫，进入衰亡期。发酵液中Lovastatin产量随发酵时间变化曲线每隔4h取样用HPLC法测定An-19菌株发酵液Lovastatin产量，Lovastatin产量随发酵时间的变化曲线见图7，发酵至116h后，发酵液中Lovastatin产量不再增高，最大值为267.02mgL。发酵液中Lovastatin提取物及其鉴定用远藤章教授方法提取Lovastatin，得到微黄色块状晶体（附图8）；用核磁共振波谱技术对Lovastatin标准品和发酵液中Lovastatin提取物分析比对，结果表明Lovastatin提取物结构与Lovastatin标准品一致，纯度较高。

权利要求：1.高产洛伐他汀（Lovastatin）的发酵方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：1）用接种针挑少量菌株菌丝，转接于PDA培养基平皿中，活化培养2~4d，所述的菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCCNO：M2015673，保藏日期为：2015年11月11日；2）取平皿中1菌饼接种于PD培养液中，摇床培养2~4d，制得一级种子；3）在种子培养液中，按种子培养液质量2~10%加入一级种子，摇床培养1~3d成二级种子；4）在发酵培养基中，按发酵培养基质量10~20%接入二级种子，发酵培养时间为110h~120h；其中，所述一级种子培养基：马铃薯20%、葡萄糖2%、牛肉膏0.5%、KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O0.1%、pH5.5~6.0；二级种子培养基：乳糖10%、甘油1%、蛋白胨0.5%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O0.1%、NaNO30.1%、pH5.5~6.0；发酵培养基：乳糖18%、甘油2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、MgSO4·7H2O0.1%，NaNO30.2%、KH2PO40.1%、ZnSO40.2%、pH5.5。2.根据权利要求1所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养条件为pH5.0~6.0，温度20~30℃。3.根据权利要求1所述的高产洛伐他汀的发酵方法，其特征在于：发酵培养的发酵罐搅拌桨转速200rmin，通气量120Lh，罐压0.1MPa~0.5MPa。

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