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申请/专利权人：金华市铁骑士生物科技有限公司

摘要：本发明公开了从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括：预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，首先将比目鱼鱼鳞以稀盐酸浸泡除杂，以乙酸溶液提取，加入胃蛋白酶酶解制得胶原蛋白，在胶原蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，经超滤后制得胶原蛋白肽。有益效果为：两次酶解法制备得到比目鱼鱼鳞胶原蛋白肽，成本低廉，酶解效率较高，反应时间较短，胶原蛋白肽的分子量均匀，活性较高。

主权项：1.从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的提取胶原蛋白肽的方法包括：预处理：将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入稀盐酸溶液中浸泡，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80‑100目筛；提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6‑8倍量乙酸溶液中提取；在2‑4℃、8500‑9000rmin条件下将酸提液离心20‑40分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:10‑15mL的比例浸入胃蛋白酶溶液中，在超声波辅助下提取；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；提取胶原蛋白肽：调节胶原蛋白液的浓度与pH值，然后，加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，将酶解液置于沸水中处理10‑15分钟灭酶，冷却后于4000‑6000rmin条件下离心20‑45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；纯化：将胶原蛋白肽溶液在2‑4℃温度下使用超滤膜进行超滤，可得到胶原蛋白肽组分。

全文数据：从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法技术领域[0001]本发明涉及胶原蛋白肽提取领域，尤其是涉及从比目鱼鱼鱗中提取胶原蛋白肽的方法。技术背景[0002]比目鱼又叫鲽鱼，硬骨鱼纲鲽形目鱼类的统称。体甚侧扁，呈长椭圆形、卵圆形或长舌形，最大体长可达5米。成鱼身体左右不对称。两眼均位于头的左侧或右侧。口稍突出。鳍一般无鰭棘。背鳍和臀鳍基底长，与尾鳍相连或不连。广泛分布于各大洋的暖热海域中，主要以底栖无脊椎动物和鱼类为食。种类繁多，全世界有540余种，中国产120种，主要类别有鳒、鲆、鲽、鳎、舌鳎等，为经济鱼类。栖息在浅海的沙质海底，捕食小鱼虾。它们特别适于在海床上的底栖生活。由于它们的身体扁平。双眼同在身体朝上的一侧，这一侧的颜色与周围环境配合得很好;它们身体的朝下一侧为白色。比目鱼的身体表面有极细密的鳞片。比目鱼只有一条背鳍，从头部几乎延伸到尾鳍。它们主要生活在温带水域，是温带海域重要的经济鱼类。[0003]鱼鳞:指鱼外表保护自身，防止水流失的外壳，一般呈扇状。鱼鳞含有丰富的蛋白质、脂肪和多种维生素，还有铁、锌、钙和多种人体必需的微量元素以及胶质。鱼鳞通常都是当做废物丢弃，既污染了环境，又浪费了资源。发明内容[0004]本发明的目的在于提供从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，本提取方法简单易行，成本低廉，酶解效率较高，反应时间较短，胶原蛋白肽的分子量均匀，活性较高。[0005]本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为:从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括:预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：预处理:将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入〇•5-0•8molL稀盐酸溶液中浸泡45-60分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80-1〇〇目筛;预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6_8倍量的3-5%乙酸溶液，然后在2_4°C温度下提取12-24小时;在2-4°C、8500-9000rmin条件下将酸提液离心20-40分钟，收集上清液;剩余残渣按lg:10_15mL的比例浸入3-5gL胃蛋白酶溶液中，调节pH为1•2-2•5，温度为10-15°C，在频率为40-60kHz、密度为0•50-0•53Wcm2的超声波辅助下提取6-8小时；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液;酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；提取胶原蛋白肽:将胶原蛋白液调整为浓度为1.5-1.6%，调节pH值至6_2-6.5,然后，加入胶原蛋白液溶质重量4-8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5•0-7•0%的茴香丙酮，在60-62。：温度下酶解25-30分钟，将酶解液置于沸水中处理1〇-丨5分钟灭酶，冷却后于4000-6000rmin条件下离心20-45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高PH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均勾、活性较高的胶原蛋白肽；_纯化:将胶原蛋白肽溶液在2-4°C温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为l〇_3〇kDa、3-10kDa、〈3kDa的胶原蛋白肽组分;胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪挫基具有整合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3_10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。_[0006]与现有技术相比，本发明的优点在于：1以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本;同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽;2胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-lOkDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。具体实施方式[0007]下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：实施例1:从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：1将比目鱼鱼鳞清洗千净，放入0.5molL稀盐酸溶液中浸泡45分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80目筛;2准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6倍量的3%乙酸溶液，然后在2°C温度下提取12小时；在2°C、8500rmin条件下将酸提液离心20分钟，收集上清液;剩余残渣按lg:l〇tnL的比例浸入3gL胃蛋白酶溶液中，调节pH为1.2,温度为10°C，在频率为40kHz、密度为0•50Wcm2的超声波辅助下提取6小时;3将胶原蛋白液调整为浓度为1•5%，调节pH值至6•2，然后，加入胶原蛋白液溶质重量4%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5•0%的茴香丙酮，在60°C温度下酶解25分钟，将酶解液置于沸水中处理1〇分钟灭酶，冷却后于4000rmin条件下离心20分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液;4将胶原蛋白肽溶液在2°C温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、3kDa的胶原蛋白肽组分;胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。[0008]实施例2:从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括:预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：1预处理:将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入〇•8mo1L稀盐酸溶液中浸泡60分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过1〇〇目筛;预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；2提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入8倍量的5%乙酸溶液，然后在4°C温度下提取24小时；在4°C、9000rmin条件下将酸提液离心40分钟，收集上清液;剩余残渣按1g:15mL的比例浸入5gL胃蛋白酶溶液中，调节pH为2.5，温度为15°C，在频率为60kHz、密度为0.53Wcm2的超声波辅助下提取8小时;酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液;酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；3提取胶原蛋白肽:将胶原蛋白液调整为浓度为1•6%，调节pH值至6•5，然后，加入胶原蛋白液溶质重量8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量7.0%的茴香丙酮，在62°C温度下酶解30分钟，将酶解液置于沸水中处理15分钟灭酶，冷却后于6000rmin条件下离心45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本;同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的疏基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；4纯化:将胶原蛋白肽溶液在4°C温度下依次使用3〇kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10_30kDa、3-lOkDa、〈3kDa的胶原蛋白肽组分;胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3_10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。[0009]实施例3:从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括:预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：预处理:将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入0•6molL稀盐酸溶液中浸泡50分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80目筛;预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入7倍量的4%乙酸溶液，然后在3°C温度下提取16小时;在3°C、8600rmin条件下将酸提液离心30分钟，收集上清液;剩余残澄按1g:12mL的比例浸入4gL胃蛋白酶溶液中，调节PH为2•〇，温度为12°C，在频率为45kHz、密度为0.52Wcm2的超声波辅助下提取7小时；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液;酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；提取胶原蛋白肽:将胶原蛋白液调整为浓度为1•5%，调节PH值至6•4，然后，加入胶原蛋白液溶质重量6%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量6•0%的茴香丙酮，在60°〇温度下酶解28分钟，将酶解液置于沸水中处理13分钟灭酶，冷却后于5500rmin条件下离心35分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高PH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；冋w回甘丨A」0IOW」以”州蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行’高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；_、纯化:将胶原蛋白肽溶液在3°C温度下依次使用30kDa、1OkDa、3kDa的超滤膜进行p虑，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、3kDa的胶原蛋白肽组分;胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪卩坐基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-l〇kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。[0010]本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。[0011]以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述的提取胶原蛋白肽的方法包括：预处理:将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入稀盐酸溶液中浸泡，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80-100目筛；提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6-8倍量乙酸溶液中提取;在2-4°C、8500-9000rmin条件下将酸提液离心2〇-40分钟，收集上清液;剩余残渣按ig:i〇-l5mL的比例浸入胃蛋白酶溶液中，在超声波辅助下提取;酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；提取胶原蛋白肽：调节胶原蛋白液的浓度与PH值，然后，加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，将酶解液置于沸水中处理1〇-15分钟灭酶，冷却后于4000_6000rmin条件下离心20-45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；纯化：将胶原蛋白肽溶液在2_4°C温度下使用超滤膜进行超滤，可得到胶原蛋白肽组分。2.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述预处理步骤中稀盐酸溶液的浓度为〇•5_〇•SmolL，浸泡时间为45_6〇分钟。3.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述提取胶原蛋白步骤中，乙酸溶液的质量分数为3_5%，提取温度为2-4°C，提取时间为12-M小时。4.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述提取胶原蛋白步骤中，胃蛋白酶溶液的浓度为3-5gL，pH为1•2-2.5，温度为l〇-l5°C，酶解时间为6-8小时。5.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述提取胶原蛋白步骤中，超声波的频率为4〇_60kHz、密度为0.50-〇.53Wcm2。6.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述提取胶原蛋白肽步骤中，将胶原蛋白液调整为浓度为1.5-1_6%。7.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述提取胶原蛋白肽步骤中，木瓜蛋白酶的添加量为胶原蛋白液溶质重量的4-8%，茴香丙酮的添加量为木瓜蛋白酶重量的5•0-7•0%，酶解温度为60-62°C，pH值为6•2-6•5，酶解时间为25-30分钟。8.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于:所述纯化步骤中的超滤膜为30kDa、10kDa、3kDa。

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