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申请/专利权人：华东理工大学

摘要：本发明涉及一种通过调控gln1基因表达提高S‑腺苷甲硫氨酸产量的方法。首次揭示将谷氨酰胺合成酶的编码基因转入S‑腺苷甲硫氨酸生产菌株，能够显著地提高S‑腺苷甲硫氨酸生产菌株的S‑腺苷甲硫氨酸产量。

主权项：一种生产S‑腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：1在S‑腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的谷氨酰胺合成酶表达盒；所述的S‑腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因ds16，并弱化了β‑胱硫醚合成酶基因的菌株；2培养步骤1制备的菌株，从而生产S‑腺苷甲硫氨酸。

全文数据：一种通过调控gIn1基因表达提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，更具体地，本发明涉及一种通过调控glnl基因表达提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。背景技术[0002]3-腺苷甲硫氨酸（3_&1611〇871-1^-11161:11；[011；[116,3厶]\0由0&111:〇11；[等人于1952年发现，作为所有生物体内的重要甲基供体，并参与多种代谢反应，SAM在抑郁症、肝脏疾病和关节炎治疗领域都具有良好的临床应用价值。因此，越来越多的研究人员利用代谢工程改变细胞的代谢途径以获得高产SAM的菌株。[0003]在生物体内，以L-Met和ATP为前体，可经SAM合成酶MAT催化合成SAM图1。其反应过程为，ATP的腺苷部分与L-Met的硫原子部分发生撞击，使得腺苷结构与甲硫氨酸相结合，从而生成具有尚能量的有机硫化物。[0004]上述提高SAM合成酶活性是获得SAM高产菌的一个重要策略。经研究发现在生物体内存在两种SAM合成酶，它们是同工酶，编码基因分别为saml和sam2，saml编码SAM合成酶I是受产物抑制的，而sam2编码的SAM合成酶II不受产物抑制，所以提高sam2基因的表达可以提高SAM合成酶的含量。因此人们利用受甲醇诱导的强启动子Α0Χ或者组成型的GAP调控sam2的表达，李东阳等将sam2基因导入pPIC3.5K转化毕赤酵母GS115使得SAM合成酶酶活提高了37倍，SAM最终产量达到了lASgLJu等（YuZL，WuXJ，LiDY，etal.EnhancementoftheproductionofSAMbyoverexpressionofSAMsynthetaseinPichiapastoris.ActaBiochimicaetBiophysicaSinica.2003,35:127-132利用组成型的GAP启动子调控SAM合成酶，导入GS115使得SAM产量显著提高。[0005]除了提高SAM合成酶的表达量，还能对SAM合成酶进行体外进化，以获得高酶活的重组酶。本发明人前期工作中（HuH,QianJC，ChuJ，etal.DNAshufflingofmethionineadenosyltransferasegeneleadstoimprovedS-adenosyl-L-methionineproductioninPichiapastoris.JBiotechnol.2009，1413:97_103利用DNAShuffling技术对SAM合成酶进行了体外进化，经过筛选获得高酶活重组SAM合成酶基因dsl6和相应的高产菌株DS16。在摇瓶中，DS16的胞内SAM累积量为1.64gL，SAM合成酶的酶活达到463UgDCW，与表达酵母SAM合成酶的重组菌相比，分别提高了102%和201%，有效改善了胞内SAM合成酶活性对SAM合成的限制。[0006]本发明人前期工作中，利用易错PCR对GAP启动子进行突变，筛选得到了强度不一的启动子，可对毕赤酵母内的基因表达进行有效调控。应用弱启动子弱化cys4基因表达，使其克服营养缺陷型的缺点，得到一株SAM高产菌G12-CBS。通过摇瓶培养产量达到了133·2mggDCW，在5L罐中重组菌G12-CBS的SAM单位菌体产量达到了146·8mggDCW。相比出发菌DS16，其单位菌体产量提高了39.3%，体积产量提高了48.8%。从发酵成本来看，G12-CBS消耗的外源L-Met量与出发菌株相比减少了15%，其L-Met转化率达到34.6%，比DS1619.4%提高了78%。[0007]以上改造都是基于对SAM相关代谢局部途径的认识来选择改造靶点的。但是，由于微生物代谢网络的系统性和复杂性，从局部代谢途径出发的改造往往具有一定的局限性。为了克服这一问题，本领域技术人员还需利用系统生物学的方法对细胞生理特性进行分析，从全基因组范围寻找影响目标产物合成的改造靶点。发明内容[0008]本发明的目的在于提供一种通过调控glnl基因表达提高S-腺苷甲硫氨酸产量的方法。[0009]在本发明的第一方面，提供一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，所述方法包括：[0010]1在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的谷氨酰胺合成酶GLN1表达盒；[0011]2培养步骤1制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。[0012]在一个优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶表达盒包括以下操作性连接的元件：A0X1启动子、编码谷氨酰胺合成酶的基因、转录终止序列较佳地为TT。[0013]在另一优选例中，所述的在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因dsl6,并弱化了β-胱硫醚合成酶CBS基因（cys4的菌株。[0014]在另一优选例中，步骤（2中，培养的方法包括：30±2°C、220±50rpm条件下进行诱导培养;每隔12±2h补入甲醇至其终浓度为1.2±0.2%VV;每隔24±4h补加L-Met较佳地，加至终浓度为0.8-1.2gL，共诱导96±12h。[0015]在另一优选例中，培养过程中调节pH5.5-6.0。[0016]在本发明的另一方面，提供一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，所述的菌株的基因组中引入了外源的谷氨酰胺合成酶GLN1表达盒。[0017]在一个优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶GLN1表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸生产菌株基因组的一号染色体的第1754722-1756086位碱基处。[0018]在另一优选例中，所述的谷氨酰胺合成酶GLN1表达盒包括以下操作性连接的元件:A0X1启动子、编码谷氨酰胺合成酶的基因，转录终止序列较佳地为TT。[0019]在另一优选例中，所述的改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因ds16，并弱化了β-胱硫醚合成酶CBS基因（cys4表达的菌株。[0020]在另一优选例中，在基因组四号染色体的第1550676个碱基之后插入dsl6。[0021]在另一优选例中，通过应用弱启动子弱化cys4基因表达，较佳地，应用GAP弱启动子较佳地为G12。[0022]在本发明的另一方面，提供谷氨酰胺合成酶GLN1的用途，用于促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸。[0023]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明[0024]图1、S-腺苷甲硫氨酸的生物合成。[0025]图2、GS115的基因组序列中可供同源重组的位点的示意图。[0026]图3、pCmGR-A_D的构建过程。[0027]图4、质粒pAOX-gln构建过程。[0028]图5、重组菌G12Gln构建过程。[0029]图6、卩0?验证6126111。]\1:]\^^1«^2,000;1&1161-6:以6126111基因组0财为模板；lanel-3:引物CYCTTFDDKC-D1024bp;lane4-6:引物RH-UA0XR-01622bp;lane7-8:以G12-CBS基因组DNA为模板，引物分别为RH-UA0XR-0和CYCTTFDDKC-D。[0030]图7、强化glnl基因对重组菌生长的影响。[0031]图8、强化glnl基因对重组菌SAM产量的影响。具体实施方式[0032]本发明人经过深入的研究，首次揭示将谷氨酰胺合成酶GLN1的编码基因（glnl转入S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，能够显著地提高S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸产量。[0033]本发明人前期工作中，以S-腺苷甲硫氨酸生产菌株DS16、G12-CBS为对象，野生菌GS115基因组插入空载体GS1153.5K作为对照菌，进行转录谱差异分析。比较导入强的SAM合成酶基因（DS16vs3.5K，弱化SAM分解代谢途径同时导入强的SAM合成酶基因（G12-CBSvs3.5K，和弱化分解途径G12-CBSvsDS16对菌株转录水平的影响，同时考察添加L-MetG12-CBS-72hvsG12-CBS-24h对菌体转录的影响。[0034]进行转录谱差异分析后，本发明人发现，相对于DS16,在重组菌G12-CBS中，glnl编码谷氨酰胺合成酶，催化谷氨酸和NH3生成谷氨酰胺）出现了显著的下调，较之DS16下降了2.0倍，这可能影响氮源的利用。在L-Met添加后，氮代谢相关基因的转录水平也出现了显著的变化，glnl下调了2.05倍。而gdh2编码谷氨酸脱氢酶，催化谷氨酸分解为α-酮戊二酸和ΝΗ3出现了显著的上调，上调了4.09倍，本发明人推测这些变化可能影响氮源的利用。因此，本发明人以菌株G12-CBS插入了dsl6基因，并弱化了cys4基因）为出发菌，进一步强化glnl表达，最终发现其可极其显著地促进SAM合成。[0035]如本文所用，"外源的"或"异源的"是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是"外源的"。[0036]如本文所用，所述的"启动子"是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游5'端），能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的活性变异体，该变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。所述变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。[0037]如本文所用，所述的"表达盒"是指包含有表达目的多肽本发明中为GLN1多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子;此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。[0038]如本文所用，所述的"可操作性连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被"可操作地连接"到该核酸序列上。[0039]NCBI已公开了GLN1蛋白序列或glnl基因序列，因此，本领域人员易于获得和制备这些基因。作为本发明的优选方式，所述的glnl具有SEQIDN0:1所示的核苷酸序列。[0040]本发明还涉及glnl的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。[0041]本发明的glnl的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。[0042]为了优化S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的S-腺苷甲硫氨酸的生产，本发明人作了广泛地研究，找到了适合于进行改良的基因glnl，并构建了相应的构建物。[0043]因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括:glnl的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件包括启动子、编码DNA以及终止子等），从而可完整地表达出相应的GLN1蛋白。[0044]本领域已知的一些诱导型或组成型启动子均适用于本发明、进行表达盒的构建。作为本发明的优选方式，所述的启动子是甲醇诱导型启动子A0X1启动子。当用于增强基因的表达时，一些强启动子是优选的。[0045]通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。为了实现在基因组上的基因定向敲除和基因定向重组，所述的表达载体还可设置合适的同源臂；同源臂的设置是本领域技术人员了解的。应理解，只要能够实现对于本发明的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的改造，任何表达载体均可选用的。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。[0046]包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是S-腺苷甲硫氨酸生产菌株。作为本发明的优选方式，所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是酵母菌株，优选地是毕赤酵母菌株，包括各种经改造的毕赤酵母菌株;最优选的，S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是G12-CBS菌株，该菌株插入了SAM合成酶基因ds16，并弱化了β-胱硫醚合成酶CBS基因（cys4的菌株。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。[0047]弱化基因表达的方法可以采用本领域已知的方法，作为本发明的优选方式，应用本发明人在先研究中提供的方法，即应用GAP弱启动子来进行cys4基因的弱化表达。[0048]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。[0049]材料与方法[0050]1、质粒、菌株和培养基[0051]实施例中所应用的质粒和菌株见表1和表2。[0052]表1、质粒[0056]大肠杆菌生长培养基：[0057]LBgL:酵母提取物10,蛋白胨20，NaC110。[0058]需要时可加适当浓度的抗生素。[0059]需要时加入Zeocin至其终浓度为25ygmL。配制固体培养基时加入琼脂粉。[0060]酵母生长培养基：[00611YPGgL:甘油20,酵母提取物10,蛋白胨20。[0062]YPDgL:葡萄糖20，酵母提取物10，蛋白胨20。[0063]YPDSgL:葡萄糖20,酵母提取物10,蛋白胨20,山梨醇182。[0064]需要时加入Zeocin至其终浓度为100ygmL。[0065]配制固体培养基时加琼脂粉20gL。[0066]酵母摇瓶发酵培养基：[0067]BSMgL:K2S〇49·1，CaS〇4〇·46，PTM112mLL，（冊42S〇47，MgS〇4·7H207·5，0·2MK2HP〇4KH2P〇4缓冲液缓冲液pH5·5。[0068]PTMlgL:CuS〇4·5H206，KI0.08，ZnS〇4·7H2020，MnS〇4·H2〇3，Na2Mo〇4·2H200.2，C〇C12·6H2〇0.5，H3B030.02，FeS〇4·7H2065,生物素0.2，H2S〇45mLL。[0069]2、工具酶、试剂盒及引物[0070]分子克隆所用限制性内切酶均购自Takara生物技术大连有限公司。质粒抽提试剂盒、胶回收试剂盒、片段纯化试剂盒均购自爱思进生物技术杭州有限公司。Zeocin购自Invitrogen公司。所用引物见表3和表4。[0071]表3、引物[0076]1种子培养[0077]挑取平板上的单菌落至2mLYPG培养基中，220rpm，30°C条件下培养过夜，再取lmL种子液至含有100mLYPG培养基的500mL摇瓶中，培养20h左右至0D6x为15-20。[0078]2摇瓶培养[0079]将种子培养液转移至50mL离心管于4,000rpm条件下离心5min，然后弃上清。重悬于含25mLBSM培养基的250mL的摇瓶中，30°C，220rpm条件下进行诱导培养。每隔12h补入一定量的甲醇，至其终浓度为1.2%VV。每隔24h补加600yLL-Met40gL。培养过程中用5molLΚ0Η调节使发酵液pH维持在5.5-6.0，共诱导96h。[0080]4、检测分析方法[008111菌体干重的测定[0082]取一定量菌液，稀释合适倍数，以无菌的培养基做空白对照，置于分光光度计中测定菌液在波长600nm处的吸光值，OD6〇q=读数X稀释倍数，通过标准曲线计算菌体干重。菌体干重Drycellweight，DCW和0D6QQ之间的关系为:DCW=0.24X0D6X+1.23R2=0·994，〇D6〇〇g[50,500]〇[0083]2粗酶液的获取[0084]取lmL发酵液，4°C条件下，12,000rpm离心2min。弃上清，将所得沉淀重悬于lmL裂解缓冲液中，转入10mL离心管中，加入等体积的直径为0.5mm的酸洗玻璃珠，在斡旋振荡器上振荡30s后立刻冰浴30s。重复10次后，将破碎的菌液转入1.5mL离心管，4°C，12，000rpm离心lOmin，取上清，用于检测。[0085]3用HPLC测定胞内SAM浓度[0086]i样品处理[0087]取lmL发酵液，4°C，12，OOOrpm，离心1Omin。弃上清，将菌体重悬于10%的三氯乙酸中，4°C条件下抽提2h。然后4°C，12，OOOrpm，离心10min，取上清，使用0·22μπι滤膜过滤，4°C保存待检测。如果是罐上的菌体则需经稀释五倍。[0088]ii测定方法[0089]色谱柱为强阳离子型离子交换柱Thermo-BioBasicSCX型号为4.6mmX250mm，5ym。流动相A为pH=4.0的5mM甲酸铵；流动相B为pH=4.0的500mM甲酸铵。洗脱过程为：〇-5.0011^11:厶；5.01-9.0011^11:厶81090;9.01-1211^11:8;12.01-14.0011^11:厶。流速11111711^11，进样量10yL，检测波长SS^nuSAM的保留时间约为lO.lmin。[0090]5、胞内SAM合成酶酶活的测定[0091]制取发酵菌体的粗酶液后，按以下体系建立酶促反应，空白对照为不加L-Met的反应。反应体系在37°C水浴锅中放置60min后，加入0.5mL20%的高氯酸溶液，4°C放置30min以上，以停止反应。然后4°C，12,000rpm，离心10min，取上清，使用0.22μηι滤膜过滤后检测。[0092]酶促反应体系（500yL还原型谷胱苷肽GSH80mM50μιΑΤΡ0.1Μ125μL,L-Met0.1Μ100[0093]离子盐溶液1.5ΜMgCl2,3ΜKC150μL.细胞裂解液100pLTris-HCl1.5MpH8j50pLddH.O25[0094]酶活的计算方法：1个酶活单位U定义为37°C下，lmin内转化生成Ιμπιοί的SAM所对应的SAM合成酶的酶活。[0095]实施例l、glnl基因强化载体构建[0096]l、pCmGR-A_D构建[0097]以PCmG参见硕士学位论文《利用无标记基因操作方法优化毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸》，乔雪锋，2013年）为出发质粒，依据GS115的基因组序列找到一处可供同源重组的序列（一号染色体的1754674位至1756106位;用于整合的位置是之间的1754722-1756086位），如图2所示，在两个开放阅读框0RF上各取约700bp作为同源臂，以GS115基因组为模板进行PCR获得同源臂，上下游同源臂分别命名为RH和DDKC。[0098]如图3,以毕赤酵母基因组DNA为模板，引物RHFRHR获得上游同源臂RH，用Xhol和Spel切除质粒pCmG上的CBS5'片段，将上游同源臂RH连接至原来CBS5'的位置，得到pCmGRH。以毕赤酵母基因组DNA为模板，引物DDKCF0DDKCR获得下游同源臂DDKC，将实验室前期已经构建好的ADH2启动子调控vgb表达的单元PADH2-vgb-TT参见学位论文《利用无标记基因操作方法优化毕赤酵母合成S-腺苷甲硫氨酸》，乔雪锋，2013年和DDKC进行重叠PCR，所用引物为PADH2F和DDKCR，获取整个大片段，用PstI和EcoRI切除质粒pCmGRH上的PGAP-CBS0RF片段，将获得的带vgb基因的重叠片段连接至PstI与EcoRI位点之间。最终得到的质粒命名为pCmGR-A-D。[0099]2、pA0X-gln构建[0100]以质粒pCmGR-A-D为出发质粒，构建步骤如图4所示，通过重叠PCR将Α0Χ启动子和glnl基因连接成一个片段，经Spel和Notl酶切，连接pCmGR-A-D，得到的质粒命名为ρΑΟΧ-gln，经酶切和测序验证序列。具体如下：[0101]以毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物Α0Χ和A0XR-0扩增获得Α0Χ序列；以毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物GlnFA-Ο和GlnR扩增获得gin序列；通过重叠PCR将Α0Χ启动子和glnl基因连接成一个片段，经Spel和Notl酶切，连接至pCmGR-A-D的相应位点中；以毕赤酵母基因组DNA为模板，以引物DDKCFP和DDKCRB扩增获得DDKC序列，经PstI和EcoRI酶切，连接上述含gIn1的过渡质粒，得到的质粒命名为pA0X-gIn。[0102]实施例2、重组菌构建[0103]1、重组菌G12Gln构建[0104]将构建好的质粒ρΑΟΧ-gln经XhoIBamHI双切，回收目的片段，电击转化G12-CBS参见《华东理工大学学报（自然科学版）》，2012年05期，"优化甲硫氨酸补料策略提高重组毕赤酵母G12-CBS合成S-腺苷甲硫氨酸"），在染色体的RH和DDKC位点发生同源双交换（图5，在含Zeocin抗性的平板上挑选单克隆。[0105]挑选阳性转化子，提前基因组DNA为模板进行PCR验证。筛选到阳性克隆的PCR产物经测序验证图6。命名为G12Gln。[0106]实施例3、重组菌的酶活与产量[0107]从Zeocin抗性平板上挑选3个阳性G12Gln克隆进行摇瓶发酵实验，以出发菌株G12-CBS作为对照菌，考察glnl基因表达强化对重组菌生长和SAM合成的影响。在摇瓶中，添加甲醇诱导后12h开始，每隔24h补入1%L-MetwV，共诱导96h，每间隔24h取样并测定菌体浓度〇D6QQ，如图7所示。发酵结束测定重组菌胞内的SAM浓度和SAM合成酶活，如图8所示。[0108]从图7看出，强化glnl基因对菌体生长没有影响。测定其SAM产量和SAM合成酶MAT活性，重组菌的MAT活性与出发菌相近，但glnl基因强化后产量达到了186.3mggDCW，比出发菌G12-CBS提高了20.6%。[0109]在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

权利要求：1.一种生产S-腺苷甲硫氨酸的方法，其特征在于，所述方法包括：1在S-腺苷甲硫氨酸生产菌株的基因组中引入外源的谷氨酰胺合成酶表达盒;所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因dsl6,并弱化了β-胱硫醚合成酶基因的菌株；2培养步骤1制备的菌株，从而生产S-腺苷甲硫氨酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的谷氨酰胺合成酶表达盒包括以下操作性连接的元件:Α0Χ1启动子、编码谷氨酰胺合成酶的基因、转录终止序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中，培养的方法包括:30±2°C、220土50rpm条件下进行诱导培养;每隔12±2h补入甲醇至其终浓度为按照体积1.2±0.2%;每隔24±411补加1^-]\161:，共诱导96±1211。4.一种改良的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株，其特征在于，所述的菌株的基因组中引入了外源的谷氨酰胺合成酶表达盒;所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因dsl6,并弱化了β-胱硫醚合成酶基因的菌株。5.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述的谷氨酰胺合成酶表达盒插入到S-腺苷甲硫氨酸生产菌株基因组的一号染色体的第1754722-1756086位碱基处。6.如权利要求4所述的菌株，其特征在于，所述的谷氨酰胺合成酶表达盒包括以下操作性连接的元件：ΑΟΧ1启动子、编码谷氨酰胺合成酶的基因，转录终止序列。7.谷氨酰胺合成酶的用途，其特征在于，用于制备谷氨酰胺合成酶表达盒并插入到S-腺苷甲硫氨酸生产菌株中，促进S-腺苷甲硫氨酸生产菌株生产S-腺苷甲硫氨酸;所述的S-腺苷甲硫氨酸生产菌株是插入了SAM合成酶基因dsl6,并弱化了β-胱硫醚合成酶基因的菌株。

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