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申请/专利权人：江汉大学;农业部科技发展中心

申请日：2015-03-31

公开（公告）日：2018-03-20

公开（公告）号：CN104805184B

专利技术分类：.包括核酸 [3,2006.01,2018.01]

专利摘要：本发明公开了一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方法，具体包括：获得变异位点；确定待测水稻品种的测试区域；构建数据库；确定抽样量后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA；制备引物；利用引物对混合样本的DNA进行扩增，扩增产物用于构建高通量测序文库；对高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组；分析测序片段组，获得待测水稻品种基因型和杂株基因型；比较获得近似品种、变异位点和变异位点率；将杂株基因型与数据库中的基因型比较，获得杂株品种后，计算杂株率；利用变异位点、变异位点率和杂株率，判断待测水稻品种特异性、一致性和稳定性。该方法能够准确、完整地判断待测水稻品种的特异性、稳定性与一致性。

专利权项：一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方法，其特征在于，所述方法包括：获得不同水稻品种间的变异位点；通过所述变异位点确定待测水稻品种的测试区域，所述测试区域包括通用测试区域，至少部分所述变异位点包含在所述通用测试区域内，通过所述变异位点确定所述通用测试区域的方法为：通过区分度计算区分度的值，其中，a为变异窗口区域中被检测到的品种总数，bi为所述变异窗口区域中第i种基因型的品种数，且bi1，k为包含大于1个品种的基因型的数目，所述变异窗口区域为以每个单核苷酸变异位点为中心，向所述单核苷酸变异位点的两侧各延伸测序列长度的12作为检测的窗口，所述通用测试区域为细胞质基因组上区分度大的区域或细胞核基因组上所述区分度大且均匀分布的区域，其中，所述基因型为所述测试区域内多个单核苷酸变异位点的组合；构建包含所述待测水稻品种在所有所述测试区域的基因型的数据库；确定所述待测水稻品种的抽样量SN后，随机抽样混合并提取混合样本的DNA，所述抽样量SN满足如下条件：BINOM.INVSN,M,0.95SN≤1.15*M，其中BINOM.INV为excel 2010中的函数，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值，所述抽样量SN满足的条件含义为：即使所述杂株率只超出阈值M的15％，所述抽样量在95％的概率保证下，可正确判断所述待测水稻品种的稳定性与一致性；制备扩增所述测试区域的引物，所述引物包括所述通用测试区域引物；利用所述引物对所述混合样本的DNA进行扩增，得到所述测试区域的扩增产物，所述扩增产物用于构建高通量测序文库；对所述高通量测序文库进行高通量测序，得到测序片段组，所述高通量测序的深度CF满足如下条件：BINOM.DIST10,10,BINOM.DIST8,20,BINOM.DIST0,CF,0.1％,TRUE,TRUE,FALSE≥99.9％，1‑BINOM.DIST10000,10000,1‑BINOM.DIST8,20,1‑BINOM.DIST99.99％*CF,CF,99.9989％,TRUE,TRUE,FALSE≤0.1％且BINOM.DIST10*1‑M*CF,10*CF,1‑110％*M,TRUE≥95.0％，其中，CF为所述高通量测序的深度，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值，BINOM.DIST为excel 2010中的函数，所述高通量测序的深度CF满足的条件含义为：在所述杂株率低至0.1％、所述杂株品种为10个且所述杂株品种与所述待测水稻品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的检出全部所述杂株品种的概率≥99.9％；在所述数据库的品种为10000个且所述杂株品种与所述待测水稻品种间平均仅有20个差异位点的条件下，由所述高通量测序的深度CF决定的存在误判所述杂株品种的概率≤0.1％；在所述杂株品种为10个且真实杂株率仅超过判断特异性时所选用的阈值的10％时，由所述高通量测序的深度CF决定的对稳定性与一致性的判定结论正确的概率≥95.0％；分析所述测序片段组，获得待测水稻品种基因型和杂株基因型；将所述待测水稻品种基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得所述待测水稻品种的近似品种、变异位点和变异位点率；将所述杂株基因型与所述数据库中的所述不同品种的基因型比较，获得杂株品种后，计算杂株率；利用所述变异位点、所述变异位点率和所述杂株率，判断所述待测水稻品种特异性、一致性和稳定性，所述测试区域还包括非通用测试区域，所述引物还包括非通用测试区域引物，当所述变异位点率≥SD或所述非通用测试区域存在所述变异位点时，所述待测水稻品种具有特异性，当所述变异位点率＜SD且所述变异位点不存在于所述非通用测试区域中时，所述待测水稻品种不具有特异性，其中，SD为判断特异性时所选用的阈值；当所述待测水稻品种的所述杂株率≤M时，所述待测水稻品种具有一致性和稳定性，当所述待测水稻品种的杂株率大于＞M时，所述待测水稻品种不具有一致性和稳定性，M为判断所述一致性和稳定性时所选用的阈值；所述杂株率R＝R1+R2‑R3‑R4，其中：其中，n1为细胞核杂株品种的数目，t1为第i1个所述细胞核杂株品种的所有特异杂株核基因型的数目，i1j1为第i1个所述细胞核杂株品种的所有所述特异杂株核基因型按频率由低到高排序后，第j1个所述特异杂株核基因型，R1i1j1为第i1j1个所述特异杂株核基因型的频率,R1为由杂株核基因型计算的所述细胞核杂株品种的所述杂株率的总和，所述细胞核杂株品种的所述杂株率为去掉所述细胞核杂株品种中最低的80％和最高的10％的所述特异杂株核基因型的频率后，剩余的所述特异杂株核基因型的频率的平均值的2倍；其中，t2为除所述细胞核杂株品种拥有的杂株核基因型之外的且频率≥0.17％的所述杂株核基因型的数目，i2为除所述细胞核杂株品种拥有的所述杂株核基因型之外的所有所述杂株核基因型按频率由低到高排序后，第i2个所述杂株核基因型，R2i2为第i2个所述杂株核基因型的频率；R2是利用除所述细胞核杂株品种拥有的所述杂株核基因型计算的所述杂株率，R2为去掉除所述细胞核杂株品种拥有的所述杂株核基因型的频率中最低的80％和最高的10％的值后，剩余值的平均值的2倍；其中，n2为细胞质杂株品种的数目，R3i3为第i3个所述细胞质杂株品种的所述杂株率，R3ic为i3＝ic时R3i3的值，ic为当所述待测品种为核质互作型不育系或保持系时，对应的所述保持系或所述不育系的所述细胞质杂株品种，t3为第i3个所述细胞质杂株品种的所有特异杂株质基因型的数目，i3j3为第i3个所述细胞质杂株品种的所有所述特异杂株质基因型按频率由低到高排序后，第j3个所述特异杂株质基因型，R3i3j3为第i3j3个所述特异杂株质基因型的频率，R3ic指混入所述不育系中的所述保持系的杂株率或混入所述保持系中的所述不育系的杂株率；R3为由杂株质基因型计算的所述细胞质杂株品种的所述杂株率的总和，所述细胞质杂株品种的杂株率为去掉所述细胞质杂株品种中最低的80％和最高的10％的所述特异杂株质基因型的频率后，剩余的所述特异杂株质基因型的频率的平均值；其中，t4为除所述细胞质杂株品种拥有的所述杂株质基因型之外的且频率≥0.17％的所述杂株质基因型的数目，i4为除所述细胞质杂株品种拥有的所述杂株质基因型之外的所有所述杂株质基因型按频率由低到高排序后，第i4个所述杂株质基因型，R4i4为第i4个所述杂株质基因型的频率；R4是利用除所述细胞质杂株品种拥有的所述杂株质基因型计算的所述杂株率，R4为去掉除所述细胞质杂株品种拥有的所述杂株质基因型的频率中最低的80％和最高的10％的值后，剩余值的平均值；Int为取整函数；所述细胞核杂株品种是指仅利用核基因型计算获得的所述杂株品种，所述细胞质杂株品种是指仅利用质基因型计算获得的所述杂株品种；所述特异杂株核基因型是指仅为一个所述细胞核杂株品种所有的所述杂株核基因型；所述特异杂株质基因型是指仅为一个所述细胞质杂株品种所有的所述杂株质基因型；所述杂株核基因型是指所述杂株基因型为所述核基因型，所述核基因型指所述基因型位于细胞核基因组上；所述杂株质基因型是指所述杂株基因型为所述质基因型，所述质基因型是指所述基因型位于细胞质基因组上。

百度查询： 江汉大学 农业部科技发展中心 一种测试纯系水稻新品种的特异性、一致性与稳定性的方法