买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

摘要：本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。通过构建该基因的超量表达载体并整合到棉花和烟草基因组中，提高了棉花和烟草植株的耐盐性。本发明的技术方案是棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。本发明还提供了改良棉花和烟草种子的植物表达载体，包括棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。本发明的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1可以提高棉花和烟草的耐盐性，为棉花和烟草育种提供一种新选择。

主权项：1.棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。

全文数据：棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用技术领域本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。背景技术我国是世界上最大的棉花生产和消费国之一，棉花生产在国民经济中占有十分重要的地位。但是随着我国人民生活水平的提高和棉花纺织产业的发展，我国棉花的生产能力已经不能满足国内的需求。中国是盐碱地大国，在盐碱地面积排前10名的国家中位居第三。中国盐碱地分布在西北、东北、华北及滨海地区在内的17个省区，盐碱荒地和影响耕地的盐碱地总面积超过5亿亩，其中具有农业发展潜力的占中国耕地总面积10％以上。虽然棉花具有一定的耐盐碱的能力，但是研究表明，在土壤中盐离子浓度高于0.4％的条件下，棉花的萌发和幼苗生长会受到抑制刘剑光等,2010。如果能进一步提高棉花的耐盐性，就可以将大量的盐碱地变为可利用的资源，在避免与粮食作物抢占耕地的前提下增加棉花的栽种面积，从而提高棉花的产量。随着人口增多和耕地面积减少，为了保证粮食安全，增加棉花产量必须避免“与粮争地”。我国拥有大量的盐碱地，提高棉花的耐盐能力对有效利用盐碱地资源具有重要意义。土壤盐渍化是一个世界性的资源和生态问题。当前，全球盐渍化土地面积已达9.5×108hm2，中国盐渍化土地面积约2亿hm2。土壤的盐渍化是限制作物产量的一个重要因素，也是世界农业生产急待解决的重要问题Maetal.,2011。若要解决这个问题，一方面，需要对盐渍土壤进行长期的改良；另一方面，需要培育出适应盐渍土壤的高度耐盐的作物新品种。棉花在长期进化的过程中产生了多种逆境胁迫的应答方式，钙离子信号途径便是其中之一。Ca2+信号通过含有EF结构域elongationfactor-hand,EF-hand的钙传感元件calciumsensor进行信号转导Dayetal.,2002。根据EF-hand结构域的数目、组成方式及氨基酸序列的同源性，含有EF-hand结构域的钙离子受体在植物中主要分为三类：钙离子依赖型蛋白质激酶Ca2+dependentproteinkinase,CDPKs、钙调素calmodulin,CaM和钙调磷酸酶B亚基类似蛋白calcineurimB-likeproteins,CBLReddyetal.,2011。细胞受到胞外或胞内刺激后，细胞质内Ca2+从内质网、线粒体、叶绿体和液泡等细胞器中释放，然后与胞内受体钙调素calmodulin,CaM或CaM相关蛋白质结合，进一步通过与细胞内多种酶或蛋白质结合以调节细胞生理生化过程Doddetal.,2010。钙调磷酸酶是Ca2+CaM依赖性的异源二聚体蛋白磷酸酶，也是迄今发现的唯一受Ca2+和钙调素calmodulin,CaM调节的丝氨酸苏氨酸蛋白质磷酸酶。钙调磷酸酶由A、B两个亚基组成，钙调磷酸酶的A亚基为催化亚基，B亚基为调节亚基，属于PP2B类蛋白磷酸酶。有研究表明，拟南芥cbl1功能缺失突变体株系相对野生型植株对外界干旱、盐胁迫以及低温更加敏感，在拟南芥中超量表达钙调磷酸酶B亚基编码同源基因AtCBL1可以提高植物对盐胁迫的耐受能力，说明CBL1是拟南芥对外界胁迫响应的一个重要调控因子Wangetal.,2007。在此基础上，我们研究了来源于棉花内源钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1对提高烟草和棉花对盐胁迫的耐受能力的作用，获得通过基因工程技术改良的耐盐性更高的作物材料。发明内容本发明的目的在于为棉花和烟草耐盐性育种提供一种新选择。本发明的又一目的在于提供含上述植物表达载体的转基因棉花和烟草的制备方法。为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。进一步地，所述的应用为棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在提高棉花植株耐盐性中的应用。进一步地，所述的应用为棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在提高烟草植株耐盐性中的应用。进一步地，所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的cDNA具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。进一步地，所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。一种改良棉花和烟草种子的植物表达载体，包括棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。进一步地，所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。进一步地，所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的cDNA具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。进一步地，所述的表达该蛋白质的元件从5’-3’方向依次包含组成型启动子p35S，棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1，终止子。本发明具有的有益效果：本发明采用了来源于花椰菜花叶病毒CaMV的组成型启动子p35S。本发明提高烟草植株耐盐性的方法：在烟草植株中组成型表达棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1，以增加烟草植株中抗逆基因的表达量，最终提高烟草耐盐性。同时，本发明通过组成型表达棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1，能够提高棉花植株的耐盐性。试验结果证明，35S:GhCBL1转基因烟草的植株生长及发育正常，可正常开花结实，幼苗生长与野生型对照无明显差异；对应的转基因棉花植株纤维断裂比强度略有下降，植株形态、种子百粒重、纤维产量及其它品质与野生型对照也无明显差异。这表明，超量表达GhCBL1对烟草和棉花植株的生长发育没有明显影响。35S:GhCBL1转基因烟草幼苗在添加有150mM和200mM的NaCl培养基中主根伸长、根毛生长及真叶发育状态均优于野生型。转基因棉花植株在含有4gkg和6gkgNaCl的土壤中生长状态优于野生型植株。转基因植株中渗透调节物质脯氨酸的含量有所增加，与植物抗逆调节相关基因的表达量也有不同程度的上调。结果表明，在棉花和烟草中超量表达GhCBL1可以提高植株对盐胁迫的耐受能力。本发明为烟草和棉花耐盐性育种提供了一种新选择，本发明还提供了一种改良棉花和烟草种子的植物表达载体。本发明所述方法简便易行，效果显著，能够提高棉花和烟草种子耐盐性，提高棉花和烟草的经济效益。附图说明图1：陆地棉类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的同源性比对图2：陆地棉GhCBL1基因在陆地棉不同组织及胚珠各个发育阶段的表达量图3：陆地棉35S:GhCBL1表达载体的构建流程图载体主要元件标示，gus:nptII：β-葡萄糖酸苷酶与新霉素磷酸转移酶的融合基因；nos：终止子；kanamycin：卡那霉素抗性基因；p35S：来源于花椰菜花叶病毒CaMV的植物组成型启动子；CaMV35SpolyA：35S终止子；T-Border：T-DNA插入边界。图4：T0代转基因烟草叶片中GhCBL1基因的表达量检测标示，CBL-5、CBL-3、CBL-12、CBL-18、CBL-14、CBL-9、CBL-6、CBL-10、CBL-13和CBL-16：不同的烟草T0代转基因株系，WT：野生型烟草。图5：烟草耐盐性分析图6：T0代转基因棉花叶片中GhCBL1基因的表达量检测图7：棉花耐盐性分析具体实施方式下面结合实施例及附图，对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。本发明实例中的试剂药品未做具体说明的均为普通市售，材料方法未做具体说明的均参考《分子克隆实验指南》Sambrook和Russell,2001。实施例中所使用的引物序列见表1。表1引物序列引物名称序列5’-3’序列号GhCBL1cDNA序列扩增引物1GGATCCATGGGCTGCTTTCAATCTAAAGSEQIDNo.4GhCBL1cDNA序列扩增引物2GTCGACTCATGTGGCAAACTCATCAACCSEQIDNo.5GhCBL1定量PCR引物1ATGACATGGATGGAACGGGTSEQIDNo.6GhCBL1定量PCR引物2CGTCCTGATTAACGTCCGCASEQIDNo.7Histone3-1GAAGCCTCATCGATACCGTCSEQIDNo.8Histone3-2CTACCACTACCATCATGGCSEQIDNo.9Gh_SOS3-FGGCTTTATCGAGCGTGAGGASEQIDNo.10Gh_SOS3-RATCTCCATTGACGGAGACGCSEQIDNo.11KIN1-FGCAGCTGGTGCTGGAGCTGGASEQIDNo.12KIN1-RCTTGTTCAGGCCGGTCTTGTSEQIDNo.13DREB2A-FCAGCAGGATTCGCTATCTGTSEQIDNo.14DREB2A-RCATCCTTTCCCTCGAGCTGASEQIDNo.15RD29A-FGACTGATGAGGTGAAGCCAGASEQIDNo.16RD29A-RCCAAGTGATTGTGGAGACTCTSEQIDNo.17Gh_Myb108-FACGTTTGGATCCCTCGTCTGSEQIDNo.18Gh_Myb108-RTTCAACCCCACCCCATGTTCSEQIDNo.19实施例1：陆地棉类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的克隆利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒Aidlab提取棉花胚珠的RNA。参照Takara说明书进行cDNA的合成，用作GhCBL1基因克隆的模板。最后用设计合成的该基因的特异引物，以上述的cDNA为模板，扩增该基因的完整cDNA序列。扩增条件如下：10×PCRbufferforKODPlus5μL，25mmolLMgSO45μL，2mmolLdNTPs2μL，引物15μmolL2μL，引物25μmolL2μL，KODPlus聚合酶1UμL，陆地棉cDNA约60ng，双蒸水补足至50μL。扩增程序为：94℃，2min；94℃，15sec；56℃，30sec；68℃，1.5min；35个循环。扩增完成后，琼脂糖电泳并回收相应DNA条带，克隆至平端载体pEASY-BluntTransGenBiotech后寄至华大公司测序验证。在NCBI数据库中，选择来自不同物种的类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1进行同源性比对。参与分析的序列：BbCNBGenBank登录号：XP_008600476.1球孢白僵菌，Beauveriabassiana，GhCBL1GenBank登录号：NP_001313993.1棉花，Gossypiumhirsutum，NtCBL1GenBank登录号：XP_016451516.1烟草，Nicotianatabacum，AtCBL1GenBank登录号：NP_567533.1拟南芥，Arabidopsisthaliana，AtCBL9GenBank登录号：NP_199521.1拟南芥，Arabidopsisthaliana。由图1可知，GhCBL1蛋白同这些来自不同物种的蛋白一样，存在着保守结构域PfamDomain,transmembranhelixregion，表明所克隆的棉花GhCBL1基因编码类钙调磷酸酶B亚基基因。实施例2：DNA片段回收，载体构建，大肠杆菌转化紫外灯下，用洁净的刀片切下含目的片段的琼脂糖凝胶块，按照试剂盒Aidlab的方法回收相应的DNA片段。载体构建流程见图3。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。回收的片段与载体建立如下连接体系：10×T4DNA连接缓冲液1μL，载体DNA片段1μL，外源连接产物DNA片段1μL，T4DNA连接酶1μL，用双蒸水补足体积至10μL的连接体系。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1：3，16℃连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α。本发明用于棉花转化的表达载体质粒的整个T-DNA区段约17.8kb，结构见图3，包括筛选标记基因和报告基因的融合基因gus:nptII、目的片段GhCBL1两个表达元件。确定筛选标记基因特性可以采用PCR进行检测，报告基因gus可通过组织化学染色确定。筛选目的片段是否已经整合到棉花DNA可通过PCR进行检测。目的基因GhCBL1构建入植物表达载体pLGN的流程见图3。在p5骨架载体的基础上，其T-DNA区段RB和LB之间区域替换成标记基因nptII的融合基因表达盒，并在P5表达盒两端各添加了一个LoxpFRT重组酶识别位点，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。根据表达载体的构建流程图，采用相应的限制性内切酶消化，按照上述的链接反应，构建GhCBL1基因的特异表达载体。实施例3：农杆菌及烟草和棉花的遗传转化1.用电激法将构建的植物表达载体质粒导入农杆菌LBA4404。参考Bio-RADMicroPulser用户说明书，将上述植物表达载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。2.超量正向表达载体整合到烟草基因组利用农杆菌介导的叶盘转化法Horsch,etal.,1985，对烟草进行遗传转化，将获得的转基因烟草植株通过GUS染色的方法进行筛选，将GUS染色呈阳性植株种植于温室中，常规管理，成熟后收集种子播种进行耐盐性分析。3.特异表达载体整合到陆地棉基因组采用农杆菌介导的方法对棉花进行遗传转化Luoetal.，2007，将获得的转基因棉花植株通过GUS染色的方法进行筛选，将GUS染色呈阳性的幼苗置于清水中，22℃培养1周后移栽至温室中，进行正常管理。实施例4：烟草和陆地棉各个组织RNA的提取及定量PCR分析利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒Aidlab提取烟草和棉花各个组织的RNA。参照RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKitMBI说明书进行cDNA一链的逆转录，用作定量RT-PCR分析模板。采用iQSYBRGreenSupermixBIO-RAD试剂分析目的基因的相对表达量。内标基因选择陆地棉的GhHIS1基因AF024716和烟草的Ncactin基因，引物为Histone3-15’-GAAGCCTCATCGATACCGTC-3’、Histone3-25’-CTACCACTACCATCATGGC-3’，以及ACT15’GATGGTGTCAGCCACACTGTC3’、ACT25’ATGCTGCTAGGAGCCAGTGC3’。GhCBL1基因表达量检测所用引物为：GhCBL1定量PCR引物15’-ATGACATGGATGGAACGGGT-3’和GhCBL1定量PCR引物25’-CGTCCTGATTAACGTCCGCA-3’。其余基因的定量PCR引物见序列表。扩增条件为：95℃预变性3min；95℃变性20s，56℃退火20s，72℃延伸30s，40个循环。计算各材料中目的基因和内标的比值，既得目的基因在不同器官组织中的相对表达量，见图2和图4。利用实时定量RT-PCR检测GhCBL1基因在冀棉14WT的茎、叶、花等不同组织及不同时期的胚珠和纤维中的表达，如图2所示，GhCBL1基因在各个营养器官以及胚珠和纤维发育的不同时期均有表达，无明显的时空表达特异性。构建了CaMV35S启动子调控GhCBL1的表达载体pLGN-35S:GhCBL1。利用农杆菌介导遗传转化将35S:GhCBL1超量表达载体导入烟草中。通过抗生素筛选和GUS组织染色鉴定的方法筛选出转基因烟草植株。将筛选获得的转基因烟草栽种于温室营养钵中，取倒数第三叶片提取RNA分析GhCBL1的表达情况。见图4，qRT-PCR结果显示，GhCBL1在烟草中均能够正常表达。GhCBL1转基因株系中，35S:GhCBL1转基因烟草10个株系与野生型进行GhCBL1的表达分析，结果CBL-5表达水平较高，比野生型提高了约900倍。通过农杆菌介导遗传转化方法将35S:GhCBL1转入冀棉14中，将GUS染色阳性的转基因棉花植株栽种于温室中，提取转基因棉花幼苗植株倒数第三叶的RNA用于测定相应基因的表达水平。如图6所示，qRT-PCR结果显示，GhCBL1-12和GhCBL1-36植株中GhCBL1基因的表达水平较高。实施例5：GhCBL1转基因烟草耐盐性分析如图5A所示，与野生型烟草相比，转基因烟草GhCBL1植株的表型没有发生明显变化。转基因烟草可以正常开花结实，其植株形态与野生型没有明显差异。如图5B所示，在不含NaCl的MS培养基上萌发培养转基因烟草，统计15d后主根长，野生型烟草的主根长为5.39±1.25cm，CBL-5和CBL-3的主根长分别为5.79±0.96cm和5.90±1.27cm，与野生型相比没有明显变化，表明转基因烟草可以正常萌发生长。在含100mMNaCl的MS培养基上生长15d后，野生型烟草的主根长为2.26±1.43cm，转基因烟草CBL-5和CBL-3转化子的主根长分别为3.33±0.64cm、和5.03±0.87cm，较野生型烟草的主根均明显变长。在含200mMNaCl的MS培养基上生长15d后，CBL-5和CBL-3转化子的根长比野生型烟草更长，且各转基因烟草植株的存活率均高于野生型植株，野生型烟草已经萎蔫变黄，转基因烟草幼苗均还存活，仅主根的伸长受到抑制。结果表明，在烟草中超量表达棉花来源的钙调磷酸酶B亚基同源基因GhCBL1可以提高烟草植株的耐盐性。实施例6：GhCBL1转基因棉花农艺形状的测定棉花耐盐性分析：选取足够数量的饱满棉花种子用1‰的H2O2的水溶液浸泡12h，均匀铺在放有多层湿润滤纸的培养皿中，再覆盖多层湿润滤纸，将培养皿置于30℃恒温暗培养箱中，待种子萌发，下胚轴伸长至2～3cm时，移至装有水的塑料杯中水培28±2℃，相对湿度85％，光照时间13hd，定时补充水分。棉花幼苗生长至2叶期，选取生长状态相近的幼苗，转移至装有0mM和200mMNaCl的水溶液的塑料培养杯中28±2℃，相对湿度85％，光照时间13hd。以0mMNaCl的水溶液处理为对照，以200mMNaCl水溶液为盐胁迫处理，试验期间隔天更换等量的溶液，分别于10d后选取相应的材料用于拍照和分析。如图7A所示，非转基因型棉花幼苗的子叶和真叶都已萎蔫，转基因棉花的子叶和真叶没有出现萎蔫或较少萎蔫，表明超量表达GhCBL1可以提高棉花幼苗的耐盐能力。利用不透水的花盆设置了对照0gkg、中度4gkg、强度6gkg三个梯度来模拟盐碱地种植移栽后的棉花幼苗，观察植株田间长势发现在对照情况下WT和转基因无差异，但在盐胁迫下，转基因棉花的株高，叶片大小，叶片数量均大于WT，见图7B所示。检测了转基因棉花成熟植株叶片中与胁迫应答相关基因表达水平的变化，以明确在棉花中超量表达GhCBL1对棉花胁迫响应途径的影响。在所检测的基因中，DREB2A可以响应ABA和渗透胁迫Liuetal.,1998；RD29A和KIN1可以受到寒冷、干旱、盐胁迫及ABA的诱导KurkelaandBorg-FrancK，1992；Tahtiharjuetal.,1997；MYB108是钙离子钙调素依赖的MYB转录因子，可以响应干旱、盐胁迫等逆境胁迫Yooetal.,2005；SOS3是植物中盐离子响应元件Chinnusamyetal.,2004；Mahajanetal.,2008。如图7C所示，qRT-PCR结果显示，在正常生长的转基因棉花中，与胁迫应答相关的基因的表达水平较野生型都有所提高。在没有外界环境诱导的情况下，在棉花中超量表达GhCBL1时，这些与逆境胁迫应答相关的基因的表达水平上调，表明转基因棉花植株在基因表达水平上具备了适应外界环境胁迫的能力。植物在受到逆境胁迫后，会激活相关基因的表达，使植物体内胁迫相关的物质发生变化以应对外界的变化。脯氨酸是植物蛋白质的重要组分之一，并且可以以游离状态广泛存在于植物体中。由于脯氨酸亲水性极强，在组织细胞内的代谢过程中，有降低凝固点和防止细胞脱水的作用。因此在逆境条件下干旱、盐碱、热、冷、冻，植物体内的脯氨酸含量会显著增加，植物体内脯氨酸的含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，因此测定脯氨酸含量是评价植物抗旱性的一个生理指标。选取温室正常生长且生长状态相近的棉花叶片，提取新鲜叶片中渗透调节物脯氨酸，如图7D所示，在没有外界环境胁迫的情况下，各转基因株系中脯氨酸含量较对照组棉花均有所提高，其中CBL-1、CBL-12和CBL-36叶片中脯氨酸含量为13.68±0.01μgg、13.49±0.01μgg和13.95±0.01μgg，较对照组的8.17±0.01μgg分别提高了67.4％和65.1％和68.2％。结果表明，棉花中超量表达GhCBL1基因，渗透调节物脯氨酸的含量升高，从而其耐盐性得到提高。棉花子指、衣分、衣指的测定：将已经收获的籽棉用机器脱绒，统计转基因棉花和非转基因棉花的子指、衣分、衣指。选100粒籽棉，轧花后，分别称量100粒棉花纤维重量也称衣指和100粒种子重量也称子指，测量棉花的衣分棉纤维的重量棉纤维+棉籽的总重。每个转基因植株选取300粒籽棉，3次重复，统计数据见表2。表235S:GhCBL1转基因棉花与野生型棉花的子指、衣分和衣指对比基因序号子指g衣分％衣指gWT10.91±0.0235.42±0.145.98±0.01CBL-19.57±0.2437.42±0.245.72±0.14CBL-1210.10±0.1936.89±0.155.90±0.11CBL-311.18±0.1936.75±0.186.50±0.11CBL-210.22±0.3235.92±0.325.73±0.18CBL-3611.00±0.0837.28±0.246.54±0.05如表2所示，对照组子指为10.91±0.02g，转基因在9.57±0.24gCBL-1到11.18±0.19gCBL-3之间，与对照相比变化不大。结果表明，在棉花中超量表达GhCBL1基因对棉花种子大小和重量没有明显的影响。棉花衣分是纤维占籽棉重量的百分比，即：衣分％＝纤维重量纤维重量+种子重量×100。统计结果显示，非转基因对照的衣分为35.42±0.14％，转基因棉花在35.92±0.32％CBL-2到37.42±0.24％CBL-1之间，与对照组相比略有上调，但变化不明显。衣指是每百粒棉籽产生纤维的重量，结果显示，对照组的衣指为5.98±0.01g，转基因棉花的衣指在5.72±0.14gCBL-1到6.90±0.11gCBL-2之间，与对照组相比没有明显差异。结果表明，在棉花中超量表达GhCBL1基因对棉花种子产生纤维的能力没有明显的影响。棉花纤维品质检测：如表3所示，纤维品质检测结果显示，转基因棉花的纤维长度在27.53±0.19mm到29.3±0.50mm之间，与对照组的29.53±0.42mm相比没有明显的变化。马克隆值作为衡量棉花纤维成熟度和细度的综合指标，在一定范围内，马克隆值越低表示纤维越细。检测结果显示，转基因棉花的马克隆值与对照组相比没有明显变化。但是转基因棉花的纤维强度较对照组略有下降。从纤维整齐度和伸长率来看，转基因棉花与对照之间没有明显差异。总体结果表明，除了纤维断裂比强度略有下降外，在棉花中超量表达GhCBL1基因对棉花纤维品质的其它指标没有显著的影响。表335S:GhCBL1转基因棉花与野生型棉花的纤维品质对比上述实施例表明，本发明改良棉花和烟草种子性状的方法，能够实现内源调控种子发育,在棉花和烟草中超量表达GhCBL1对植株的生长发育没有明显影响，可以提高棉花和烟草植株对盐胁迫的耐受能力。以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，依据本发明的技术实质，在本发明的精神和原则之内，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。SEQUENCELISTING110西南大学120棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用130201816018170PatentInversion3.32101211642212DNA213人工序列4001atgggctgctttcaatctaaagtaacaagacaataccctggacacgaagatcctattatt60ctagcttctcaaactgcttttagtgttagtgaagttgaagcactctttgagctattcaag120agcataagcagttctgtgattgatgatgggctgatcaacaaggaagagtttcaattagca180ctgtttcagaataggaagaaggagaacattttcgcaaatcggatttttgatttatttgac240gcaaagaagaagggagtcattgattttggtgactttgttcgagcactcaatgtcttccat300ccaaatgtctcacaagaggacaagatgaattttgcgtttagactctatgacatggatgga360acgggttttattgagcgtaacgaggtcaagcaaatggtgattgcactgttatgtgaatct420gaaatgaagttagctgatgaaaccattgaggcaattcttgataagacattcttggatgcg480gacattaatcaggacgggaagatcgatatatctgaatggaaaaacttcgtttcccgtaac540ccatcactgttgaaaatcatgacccttccatacctcagggatataacaacaacatttcct600agctttgttttccattctgaggttgatgagtttgccacatga6422102211213212PRT213人工序列4002MetGlyCysPheGlnSerLysValThrArgGlnTyrProGlyHisGlu151015AspProIleIleLeuAlaSerGlnThrAlaPheSerValSerGluVal202530GluAlaLeuPheGluLeuPheLysSerIleSerSerSerValIleAsp354045AspGlyLeuIleAsnLysGluGluPheGlnLeuAlaLeuPheGlnAsn505560ArgLysLysGluAsnIlePheAlaAsnArgIlePheAspLeuPheAsp65707580AlaLysLysLysGlyValIleAspPheGlyAspPheValArgAlaLeu859095AsnValPheHisProAsnValSerGlnGluAspLysMetAsnPheAla100105110PheArgLeuTyrAspMetAspGlyThrGlyPheIleGluArgAsnGlu115120125ValLysGlnMetValIleAlaLeuLeuCysGluSerGluMetLysLeu130135140AlaAspGluThrIleGluAlaIleLeuAspLysThrPheLeuAspAla145150155160AspIleAsnGlnAspGlyLysIleAspIleSerGluTrpLysAsnPhe165170175ValSerArgAsnProSerLeuLeuLysIleMetThrLeuProTyrLeu180185190ArgAspIleThrThrThrPheProSerPheValPheHisSerGluVal195200205AspGluPheAlaThr210210321128212DNA213人工序列4003ggatccatgggctgctttcaatctaaag28210421128212DNA213人工序列4004gtcgactcatgtggcaaactcatcaacc28210521120212DNA213人工序列4005atgacatggatggaacgggt20210621120212DNA213人工序列4006cgtcctgattaacgtccgca20210721120212DNA213Unknown220223人工序列4007gaagcctcatcgataccgtc20210821119212DNA213人工序列4008ctaccactaccatcatggc19210921120212DNA213人工序列4009ggctttatcgagcgtgagga202101021120212DNA213人工序列40010atctccattgacggagacgc202101121121212DNA213人工序列40011gcagctggtgctggagctgga212101221120212DNA213人工序列40012cttgttcaggccggtcttgt202101321120212DNA213人工序列40013cagcaggattcgctatctgt202101421120212DNA213人工序列40014catcctttccctcgagctga202101521121212DNA213人工序列40015gactgatgaggtgaagccaga212101621121212DNA213人工序列40016ccaagtgattgtggagactct212101721120212DNA213人工序列40017acgtttggatccctcgtctg202101821120212DNA213人工序列40018ttcaaccccaccccatgttc20

权利要求：1.棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用。2.根据权利要求1所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用，其特征在于：所述的应用为棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在提高棉花植株耐盐性中的应用。3.根据权利要求1所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用，其特征在于：所述的应用为棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在提高烟草植株耐盐性中的应用。4.根据权利要求1～3任一项所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用，其特征在于：所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的cDNA具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1～3任一项所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用，其特征在于：所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。6.一种改良棉花和烟草种子的植物表达载体，其特征在于，包括棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质，或表达该蛋白质的元件，或表达该蛋白质的载体，或表达该蛋白质的宿主细胞。7.根据权利要求6所述的改良棉花和烟草种子的植物表达载体，其特征在于：所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1编码的蛋白质具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。8.根据权利要求6所述的改良棉花和烟草种子的植物表达载体，其特征在于：所述的棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1的cDNA具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。9.根据权利要求6所述的改良棉花和烟草种子的植物表达载体，其特征在于：所述的表达该蛋白质的元件从5’-3’方向依次包含组成型启动子p35S，棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1，终止子。

百度查询： 西南大学 棉花类钙调磷酸酶B亚基基因GhCBL1在棉花和烟草育种中的应用