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申请/专利权人：华南理工大学

摘要：本发明公开一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用，属于工业微生物领域。本发明通过同源重组的方法对集胞藻PCC6803中的sll0528基因进行敲除和过表达，得到一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株Osll0528。在加有不同浓度1.5％，2.0％，2.5％，3.0％vv乙醇的BG11培养基中，该藻株的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的乙醇耐受性藻株对构建生产燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。

主权项：1.sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用，其特征在于：过表达sll0528基因提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性，敲除sll0528基因降低集胞藻PCC6803乙醇耐受性。

全文数据：sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用技术领域本发明属于工业微生物领域，具体涉及一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用。背景技术能源危机以及化石燃料造成的环境污染和温室效应的日益加重，激起了人们对可再生绿色生物燃料的兴趣。生物乙醇是一种绿色可再生能源，其出现不仅减少了对石油资源的依赖，也大大减少了二氧化碳的排放。蓝藻可以利用二氧化碳通过光合作用直接合成生物乙醇，已经展现了在未来生产绿色燃料方面的巨大潜力。集胞藻PCC6803作为一种光合蓝藻，因其易于进行分子生物学操作，已广泛被用作基因工程菌用于生物乙醇的开发。但是目前为止生物乙醇的产量还远远不能满足工业化生产的要求，其中一个重要的原因就是集胞藻PCC6803对乙醇的耐受能力差。因此，提高集胞藻PCC6803对于乙醇的耐受能力，对于未来工业化生产生物乙醇，解决能源危机具有重要的作用。发明内容为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用。本发明的另一目的在于提供一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株的构建方法。本发明的另一目的在于提供通过上述构建方法构建得到的一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株。该藻株可应用于构建生产生物乙醇的基因工程菌。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用。过表达sll0528基因提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性，敲除sll0528基因降低集胞藻PCC6803乙醇耐受性。进一步的，所述的sll0528基因在构建对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株中的应用。所述的sll0528基因的核苷酸序列如a、b或c所示：asll0528基因的cDNA序列，如SEQIDNO：17所示；bsll0528基因的基因组DNA序列；c与a或b具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。本发明通过将野生型与构建的集胞藻PCC6803中sll0528基因的敲除株Δsll0528以及过表达株Osll0528的比较，鉴定出了一种与乙醇耐受相关的基因sll0528，其序列号如SEQIDNO：17所示，并成功得到了一株可以显著提高乙醇耐受性的藻株。一种sll0528基因敲除株Δsll0528的构建方法，包括如下步骤：1以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2作为待敲除基因sll0528上游的上、下游引物，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4为待敲除基因sll0528下游的上、下游引物，通过PCR扩增得到待敲除基因sll0528上游片段sll0528-up及下游片段sll0528-down。以质粒pACYC184为模板，以SEQIDNO：5和SEQIDNO：6为上、下游引物，通过PCR扩增得到包含氯霉素抗性基因的片段Cmr；2以限制性内切酶BamHI和NdeI，XhoI和SacI，BamHI和SacI依次剪切获得的目的片段sll0528-up，sll0528-down，Cmr，并将其插入载体质粒PET-30b中，得到同源重组双交换质粒PET-Cmr；3将同源重组双交换质粒PET-Cmr以自然转化的方式转入集胞藻PCC6803中，得到的转化子以不同浓度的氯霉素进行筛选，并在DNA水平上进行鉴定，最终得到sll0528基因完全敲除的单克隆藻株，命名为Δsll0528。一种sll0528基因过表达株Osll0528的构建方法，包括如下步骤：1以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQIDNO：7和SEQIDNO：8作为目的片段slr2030的上、下游引物，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12为psbA2启动子的上、下游引物，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14为sll0528的上、下游引物，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16为slr2031的上、下游引物，通过PCR扩增得到slr2030，psbA2启动子，sll0528，slr2031。以质粒pET-30b为模板，以SEQIDNO.9和SEQIDNO.10作为引物，PCR扩增得到卡那霉素抗性基因kmr片段；2用限制性内切酶HindⅢ和PstⅠ，PstⅠ和PstⅠ，PstⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和SmaⅠ，SmaⅠ和EcoRⅠ依次剪切获得的slr2030，kmr，psbA2启动子，sll0528，slr2031目的片段，并将其插入载体质粒pUC118中，得到同源重组双交换质粒P3031。3将同源重组双交换质粒P3031以自然转化的方式转入集胞藻PCC6803中，得到的转化子以不同浓度的卡那霉素进行筛选，并在DNA水平上进行鉴定，最终得到sll0528基因的过表达株，命名为Osll0528。本发明通过上述构建方法，得到了集胞藻PCC6803中sll0528的敲除株Δsll0528以及过表达株Δsll0528，鉴定出了一种与乙醇耐受相关的基因sll0528，并得到了一株耐乙醇的藻株Osll0528。通过上述方法构建的藻株Osll0528对乙醇的耐受能力显著提高，其在含有1.5～3.0％vv优选为1.5～2.0％vv乙醇的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。所述的藻株Osll0528可用于构建生产燃料乙醇的基因工程菌。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明通过同源重组的方法对集胞藻PCC6803中的sll0528基因进行敲除和过表达，得到一种对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803藻株Osll0528。在加有不同浓度乙醇的BG11培养基中，该藻株的生长状态明显优于野生型藻株。本发明得到的乙醇耐受性藻株对构建生产燃料乙醇的基因工程菌具有重要的理论和实际意义，具有广泛的应用前景。附图说明图1是同源重组双交换质粒PET-Cmr的结构示意图。图2是同源重组双交换质粒P3031的结构示意图。图3是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在1.5％vv乙醇胁迫下的生长曲线图，图中E代表乙醇。图4是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在2.0％vv乙醇胁迫下的生长曲线图，图中E代表乙醇。图5是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在2.5％vv乙醇胁迫下的生长曲线图，图中E代表乙醇。图6是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在3.0％vv乙醇胁迫下的生长曲线图，图中E代表乙醇。图7是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在乙醇浓度分别为0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％vv下第四天的趋势图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明实施例中使用的集胞藻PCC6803野生型藻株从ATCC27184中分离纯化得到，ATCC是美国菌种保藏中心的简称，27184是菌株编号。质粒pUC118，pACYC184购自Takara公司，pET-30b购自Novagen公司。实施例1同源重组双交换质粒PET-Cmr和P3031的构建：1插入片段的扩增：以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQIDNO：1和SEQIDNO：2作为待敲除基因sll0528上游的上、下游引物，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4为待敲除基因sll0528下游的上、下游引物，通过PCR扩增得到待敲除基因sll0528上游片段sll0528-up及下游片段sll0528-down。以质粒pACYC184为模板，以SEQIDNO：5和SEQIDNO：6为上、下游引物，通过PCR扩增得到包含氯霉素抗性基因的片段Cmr；以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQIDNO：7和SEQIDNO：8作为目的片段slr2030的上下游引物，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12为psbA2启动子的上、下游引物，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14为sll0528的上、下游引物，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16为slr2031的上、下游引物，通过PCR扩增得到slr2030，psbA2启动子，sll0528，slr2031。以质粒pET-30b为模板，以SEQIDNO.9和SEQIDNO.10作为引物，PCR扩增得到卡那霉素抗性基因kmr片段。本发明中集胞藻PCC6803的基因组提取采用植物基因组DNA快速提取试剂盒广州东胜生物科技有限公司，货号N1191，质粒提取采用高纯度质粒小量提取试剂盒广州东胜生物科技有限公司，货号N1011。PCR反应采用20μL体系：模板1μL，10×PCRBufferMg2+plus2μL，dNTPMixture各2.5mM1.6μL，上游引物1μL10μM，下游引物1μL10μM，rTaq酶0.2μL，ddH2O13.2μL。向PCR管中加入各反应组分，短暂离心后，置于PCR仪上进行扩增反应。扩增程序为：预变性，94℃，3min；变性，98℃，10s；退火，温度一般比引物Tm值低5～10℃，时间为15s；延伸，72℃，每扩增1kbDNA需1min；循环，变性-退火-延伸的循环38个；72℃，5min；16℃，10min。PCR产物大小经琼脂糖电泳验证，与理论长度一致。在进行后续实验前，各PCR产物还需胶回收纯化。2插入片段与质粒的酶切连接以限制性内切酶BamHI和NdeI将得到的sll0528-up片段和PET-30b载体进行双酶切。插入片段的双酶切采用30μL体系：DNA10μL，10×Buffer3μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH2O15μL。质粒的双酶切采用20μL体系：DNA10μL，10×Buffer2μL，两种快速酶切酶各1μL，ddH2O6μL。酶切反应温度为37℃，时间为1h。反应结束后，80℃温浴5min，灭活酶。酶切产物经胶回收纯化后，以T4DNA连接酶进行连接反应。连接反应采用20μL体系：插入片段DNA12μL，质粒DNA5μL，10×Buffer2μL，酶1μL。连接反应温度为16℃，反应8h后，将连接产物转化至大肠杆菌DH5α中。对长出的转化子进行鉴定是否连接成功，连接成功的质粒经Sanger测序确认，从而得到质粒PET-30b-up。以相同的酶切反应和连接反应条件，将sll0528-down片段和Cmr片段和质粒PET-30b-up连接，酶切位点为XhoI和SacI，SacI和BamHI，得到同源重组双交换质粒PET-Cmr，其结构示意图如图1所示。按顺序将目的片段slr2030，kmr，psbA2启动子，sll0528，slr2031与质粒pUC118连接，酶切位点分别为HindⅢ和PstⅠ，PstⅠ和PstⅠ，PstⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和SmaⅠ，SmaⅠ和EcoRⅠ，得到同源重组双交换质粒P3031，其结构示意图如图2所示。实施例2sll0528基因敲除株Δsll0528和sll0528基因过表达株Osll0528的获得1质粒转化将同源重组双交换质粒PET-Cmr用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌后，装入2mL无菌离心管中。向其中加入一定量BG11培养基已加入HEPES缓冲液，使质粒终浓度约为10ngμL。取30mL处于对数期的野生型PCC6803，6000rpm离心7min，去上清。用20mL新鲜BG11培养基重悬藻泥，6000rpm离心7min，去上清。用含质粒的培养基把藻泥重悬。将重悬的藻液在29℃，150rpm，1400Lux连续光照培养6h。将藻液涂于铺有混合纤维滤膜的固体培养基中光照培养1天正置培养后，将膜转移至含有10μgmL氯霉素的固体培养基中，光照培养数天至膜表面长出单藻落。最后，将长出的藻落转移至含有相同浓度氯霉素的20mLBG11小瓶培养基中培养，待长至对数期后转接。同源重组双交换质粒P3031的转化方法同上所述，所加的抗生素由氯霉素变为卡那霉素。2藻株筛选将步骤1中得到的藻液进行转接培养，培养条件为29℃，150rpm，1400Lux连续光照。转接时，将BG11培养基中抗生素浓度提高到20μgmL。待长至对数期再进行转接，以后每次转接培养基中抗生素的浓度提高10μgmL。当培养基中的抗生素浓度达到50μgmL时，将藻液平板划线。待平板上长出单藻落后，挑取单藻落至含有相应抗生素浓度的BG11培养基中培养，最终获得基因敲除株Δsll0528和基因过表达株Osll0528。3PCR和测序验证对于敲除株Δsll0528，分别用引物SEQIDNO：1和SEQIDNO：2，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4，SEQIDNO：5和SEQIDNO：6在野生型藻株和突变体藻株中扩增Sll0528左同源臂，右同源臂，和氯霉素基因。用SEQIDNO：18和SEQIDNO：19扩增敲除的Sll0528片段基因。野生型藻株不能扩增出氯霉素基因；突变体藻株敲除株中不能扩增出Sll0528片段基因，且有氯霉素基因的存在。经测序，扩增得到的基因序列符合预期，说明氯霉素基因已取代基因sll0528，敲除株Δsll0528构建成功。对于过表达株Osll0528，利用引物SEQIDNO：20和SEQIDNO：21在野生型藻株和过表达株Osll0528中扩增，野生型扩增结果为中性位点slr2030和slr2031之间的部分片段，长度为1001bp，而过表达株Osll0528中则为Kmr，启动子psbA2以及插入的sll0528三部分，共3350bp，经测序，结果符合预期，证明过表达株Osll0528构建成功。本发明中所用BG11培养基配方：1L培养基中含有NaNO31.5g，K2HPO40.04g，MgSO4·7H2O0.075g，EDTA0.001g，CaCl2·2H2O0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁铵0.006g，Na2CO30.02g，H3BO30.00286g，MnCl2·4H2O0.00181g，ZnSO4·7H2O0.000222g，Na2MoO4·2H2O0.00039g，CuSO4·5H2O0.000079g，CoNO32·6H2O0.0000494g。使用时，每50mL培养基中加入1mL1molL的HEPES缓冲液pH＝7.5。配制固体培养基时，再加入2％的琼脂。实施例3集胞藻PCC6803野生型，基因敲除株Δsll0528，基因过表达株Osll0528在乙醇胁迫下的表型分析：将生长至对数期的野生型，Δsll0528，Osll0528作为种子液，分别接种至含有0％vv，1.5％vv，2.0％vv，2.5％vv，3.0％vv乙醇的50mLBG11培养基中，每瓶藻的起始OD730＝0.1。连续培养4天，每天取样测OD730值，绘制生长曲线。培养条件为30℃，150rpm，1800Lux连续光照，实验组和对照组各三个平行。图3～6是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在1.5％，2.0％，2.5％，3.0％vv乙醇胁迫下的生长曲线图，图中E代表乙醇。从图中可以看出，分别在1.5％，2.0％，2.5％，3.0％vv几个浓度的乙醇胁迫下进行比较，Osll0528的生长状态明显优于野生型，而敲除体Δsll0528生长状态最差。图7是集胞藻PCC6803野生型WT，Δsll0528和Osll0528藻株在乙醇浓度分别为0％，1.5％，2.0％，2.5％，3.0％vv下第四天的趋势图。从图中可以看出，不同浓度下Osll0528的生长状态均为最佳，而敲除体Δsll0528生长状态最差，两者差异在乙醇浓度为1.5％和2.0％时最为明显。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表华南理工大学sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用21SIPOSequenceListing1.0134DNA人工序列ArtificialSequence1ggaattccatatgctggttatggtggtttactga34230DNA人工序列ArtificialSequence2cgcggatccatgttaagaattgcctgagtg30328DNA人工序列ArtificialSequence3cgagctcctacggaagacatcaaacacg28429DNA人工序列ArtificialSequence4ccgctcgagggcgaaatgttgaccttgac29527DNA人工序列ArtificialSequence5cgcggatcctcatcagtgccaacatag27627DNA人工序列ArtificialSequence6cgagctcggtaaaccagcaatagacat27731DNA人工序列ArtificialSequence7cccaagcttacactacattaccggacaaact31830DNA人工序列ArtificialSequence8aaaactgcagtcttcctggggacgaaaacg30929DNA人工序列ArtificialSequence9aactgcagctcagttcggtgtaggtcgtt291030DNA人工序列ArtificialSequence10aactgcagcattcaaatatgtatccgctca301131DNA人工序列ArtificialSequence11aaaactgcagtatcagaatccttgcccagat311231DNA人工序列ArtificialSequence12tgctctagattggttataattccttatgtat311330DNA人工序列ArtificialSequence13tgctctagaatgttaagcctcagtttaggg301430DNA人工序列ArtificialSequence14tcccccgggatcccaatctttatggtttcc301530DNA人工序列ArtificialSequence15tcccccgggaggagttggtggctaagttgt301629DNA人工序列ArtificialSequence16ccggaattctccaggtcggcatacattac29171140DNA人工序列ArtificialSequence17atgttaagcctcagtttaggggggcagtttatgaacaacaatatccgcgtcggcagtctg60tttggcattcctttttacgtcaacccatcctggtttttaattttaggattggtgaccctg120agctatggccaagacttagcccgctttccccaactttccggtggcacaccctggattttg180gggttaattacagctttactcctctttgcttccgttgtcgcccacgagttgggccatagt240ttggttgccttagcccagggcattgaagttaaatccatcactctgtttttgttcggtggt300ctagcgagtttagaaaaggaatccaacactccctggcaagcttttgcggtggcgatcgcc360gggccggcggtgagtttagtgctctttttgggtttaaccatagttggtacccaaatcccc420ctacctgtgccggggcaggccatcattggtttattgggcatgatcaacctcgccctggca480ttgtttaacctcattcctggtttacctttggacggcggcaatgtgctcaaatccattgtg540tggcaaatcacgggcaatcaaaacaaaggtattctcattgctagtcgggtgggccagggt600ttcggttggttggcgatcgccattggtagcttaggtattttaaatattctgcccatcggt660agcttctggaccattttgatcggttggttcctgttacaaaatgctggttcctccgcccgc720aacgcccaggtcaaagagcaaatggaagcctttactgctgaagatgcggttattcccaac780agccccattattcctgccgggttaaatattcgggaatttgctaacgattatgtgattggt840aaaaccccctggcgacggttcttggttattggtgccgacaatcaactgttaggtgtactt900gctacggaagacatcaaacacgtccccacttccgattggccccaggtcacagtggatagc960ttgatgcagtatccccaacagatggtcaccgttaacgccaatcaatctttgtttgaagtg1020gcccagttgttagatcaacagaaactgtcggaacttttggtggtgcaaccttcgggagaa1080gtggtgggattattggaaaaagcttccatcatcaaatgtctgcaaacctccgccgcctag11401819DNA人工序列ArtificialSequence18atgttaagcctcagtttag191920DNA人工序列ArtificialSequence19caagtacacctaacagttga202020DNA人工序列ArtificialSequence20agggacttagcccagtttca202121DNA人工序列ArtificialSequence21cccaacagatcctgcacttta21

权利要求：1.sll0528基因在提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性中的应用，其特征在于：过表达sll0528基因提高集胞藻PCC6803乙醇耐受性，敲除sll0528基因降低集胞藻PCC6803乙醇耐受性。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的sll0528基因在构建对乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株中的应用。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述的sll0528基因的核苷酸序列如a、b或c所示：asll0528基因的cDNA序列，如SEQIDNO：17所示；bsll0528基因的基因组DNA序列；c与a或b具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。4.一种乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：1以野生型集胞藻PCC6803基因组为模板，以序列表中SEQIDNO：7和SEQIDNO：8作为目的片段slr2030的上、下游引物，SEQIDNO：11和SEQIDNO：12为psbA2启动子的上、下游引物，SEQIDNO：13和SEQIDNO：14为sll0528的上、下游引物，SEQIDNO：15和SEQIDNO：16为slr2031的上、下游引物，通过PCR扩增得到slr2030，psbA2启动子，sll0528，slr2031；以质粒pET-30b为模板，以SEQIDNO.9和SEQIDNO.10作为引物，PCR扩增得到卡那霉素抗性基因kmr片段；2用限制性内切酶HindⅢ和PstⅠ，PstⅠ和PstⅠ，PstⅠ和XbaⅠ，XbaⅠ和SmaⅠ，SmaⅠ和EcoRⅠ依次剪切获得的slr2030，kmr，psbA2启动子，sll0528，slr2031目的片段，并将其插入载体质粒pUC118中，得到同源重组双交换质粒P3031；3将同源重组双交换质粒P3031以自然转化的方式转入集胞藻PCC6803中，得到的转化子以不同浓度的卡那霉素进行筛选，并在DNA水平上进行鉴定，最终得到sll0528基因的过表达株，命名为Osll0528。5.一种乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株，其特征在于：通过权利要求4的构建方法构建得到。6.根据权利要求5所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株，其特征在于：所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株，在含有1.5～3.0％vv乙醇的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。7.根据权利要求5或6所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株，其特征在于：所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株，在含有1.5～2.0％vv乙醇的BG11培养基中的生长状态明显优于野生型藻株。8.权利要求5～7任一项所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株的应用，其特征在于：所述的乙醇耐受性显著提高的集胞藻PCC6803菌株用于构建生产燃料乙醇的基因工程菌。

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