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申请/专利权人：中国人民解放军第二军医大学第二附属医院

摘要：一种人原代骨肉瘤细胞株NEO217‑luc及其构建方法和应用，所述细胞株NEO217‑luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO：C2018179。该细胞株NEO217‑luc的细胞有重叠生长的能力，细胞异型性明显，具有骨肉瘤细胞的形态特征，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系，可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立骨肉瘤免疫缺陷小鼠体外模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，可应用于制备、筛选、评价抗脊柱骨肉瘤药物。

主权项：1.一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217‑luc，其特征在于，所述细胞株NEO217‑luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCC NO：C2018179。

全文数据：一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用技术领域本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用。背景技术骨肉瘤是最常见的骨恶性肿瘤之一。然而脊柱骨肉瘤非常罕见，患病率仅占所有原发性骨肉瘤的3％。虽然骨肿瘤外科医生建议对任何原发性骨肉瘤进行大范围的切除术，但是与四肢骨肉瘤相比，脊柱骨肉瘤的预后较差。在过去的几十年里，已经有一些关于人骨肉瘤细胞系建立的报道。然而很少有人建立脊柱骨肉瘤细胞系，这使得研究脊柱骨肉瘤的生物学行为变得困难。因此，建立脊柱骨肉瘤细胞系作为临床相关的脊柱骨肉瘤模型来研究其生物学行为具有重要的临床意义。发明内容本发明的目的在于提供来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc及其构建方法和应用，该种新型人原代骨肉瘤细胞株，为研究病人体内骨肉瘤的发生、耐药机制及治疗提供良好的体外模型，进而促进脊柱骨肉瘤的基础研究、预防及临床诊治。为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，该细胞株NEO217-luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCCNO：C2018179。本发明还提供了所述人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc的构建方法，其包括如下步骤：1将脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将标本反复剪切至糜状，移入装有10mlDMEM培养基的无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素100Uml、链霉素100mgml，放入恒温振荡仪中在37℃下以200次min的速度进行振荡，振荡2小时候后取出、用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将收集的液体缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中，放入离心机中2500转min、离心30min；离心完毕后取出，将中间的细胞层用吸管小心吸出置入另一离心管中，5mLPBS对吸出的细胞层吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞；2将步骤1处理获得的组织细胞接种于细胞培养瓶中，加入含有20％胎牛血清、青霉素100UmL、链霉素100mgmL的DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；培养第3天进行半量换液一次，第5天进行全量换液一次，第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代；3将传代的细胞接种于新的细胞培养瓶中，加入含有10％胎牛血清、青霉素100Uml、链霉素100mgml的DMEM培养基进行培养；在培养的过程中，挑选不同代数的细胞进行冻存保种，收集细胞后将细胞用冻存液重悬，将冻存管放入液氮罐中保存，将该细胞系命名为NEO217。4将荧光素酶基因Fireflyluciferase基因整合到细胞NEO217染色体DNA上，使细胞表达荧光素酶，构建出稳定表达荧光素酶的细胞株。本发明通过对NEO217进行luciferase基因修饰后，这种细胞株在进行动物体内实验时，将稳定细胞株接种到动物体内，一定时间后腹腔注射底物荧光素luciferin，在几分钟可以发光，即可用仪器检测，发光强度与细胞的数目相关，使体内实验更加直观，方便掌握实验时间及进程等。我们将这种携带荧光素酶基因的NEO217进一步命名为NEO217-luc，得到保藏编号为CCTCCNO：C2018179的人原代骨肉瘤细胞株。本发明上述构建方法得到的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc经染色体G带核型分析表明其存在染色体异常。经裸鼠致瘤实验证实：本发明的所述人原代骨肉瘤细胞株能够导致裸鼠成瘤，具有致瘤性。本发明还提供所述人原代骨肉瘤细胞株在建立人脊柱骨肉瘤发生机理模型中的应用。本发明还提供所述人原代骨肉瘤细胞株在建立体外的人脊柱骨肉瘤动物模型中的应用。本发明还提供所述人原代骨肉瘤细胞株可应用于制备、筛选、评价抗脊柱骨肉瘤药物中的应用。本发明建立的人原代骨肉瘤细胞系可用于研究脊柱骨肉瘤的有用分子工具，将有助于理解与这些癌症的发展相关的分子事件。此外，该细胞系可用于测试新的治疗策略以初步预测其功效。本发明的有益效果：本发明构建了一种新型人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，该细胞株来源于脊柱，其细胞有重叠生长的能力，细胞成多角形，核大，胞浆相对较少，核仁1-2个，细胞异型性明显，具有骨肉瘤细胞的基本形态特征，符合建系标准，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系。本发明构建的人原代骨肉瘤细胞株可在培养基中进行体外培养，且体外培养生长快速稳定、能连续传代，进而方便建立骨肉瘤免疫缺陷小鼠体外模型；免疫缺陷鼠皮下成瘤性好，且肿瘤随着时间的延长生长迅速且浸润性强，良好的成瘤性为药物的体内试验提供了重要的保证，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，进而为制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。附图说明图1为本发明实施例1倒置相差显微镜下新型人骨肉瘤细胞株细胞照片。图2为本发明实施例1中骨肉瘤细胞株细胞透射电镜图片。图3为本发明实施例2中骨肉瘤细胞株细胞生长周期。图4为本发明实施例3中骨肉瘤细胞株细胞生长曲线。图5为本发明实施例4中骨肉瘤细胞株细胞染色体分析结果。图6为本发明实施例5中骨肉瘤细胞株细胞与MNNGHOS和MG63细胞侵袭能力对比图。图7为本发明实施例5中骨肉瘤细胞株细胞与MNNGHOS和MG63细胞迁移能力对比图。图8为本发明实施例6中骨肉瘤细胞株细胞在免疫缺陷小鼠皮下致瘤后皮下肿瘤的HE染色结果。图9为本发明实施例6中骨肉瘤细胞株细胞异种移植瘤组织HE染色结果。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明。本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例1原代培养和脊柱骨肉瘤细胞系的建立脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本一部分送往病理科进行病理学检测证实为骨肉瘤，另一部分标本装入盛有Hank`s液的50ml无菌离心管中立即送往细胞培养室进行后续的处置工作。在细胞超净工作台中将离心管中的标本倒入10cm的无菌培养皿中，用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将组织块反复剪切至糜状，将组织移入装有10mlDMEM培养基Gibco，USA的50ml无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素100Uml、链霉素100mgml，放入恒温振荡仪中在37℃的条件下以200次min的速度进行振荡，2小时候取出后用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将其壁缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的15毫升无菌离心管中，放入离心机中2500转min水平离心30min。离心完毕后取出，将中间的细胞层小心用吸管吸出置入另一离心管中，5毫升PBS对其吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞。将经过上述处理获得的细胞接种于25cm2的细胞培养瓶中，加入含有20％胎牛血清、青霉素100UmL、链霉素100mgmL的DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养。每天用倒置相差显微镜定期观察细胞生长情况，第3天进行半量换液一次。第5天进行全量换液一次。第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代。将传代后的细胞接种于新的25cm2的细胞培养瓶中，加入含有10％胎牛血清、青霉素100Uml、链霉素100mgml的DMEM培养基进行培养。在培养的过程中，挑选不同代数的细胞进行冻存保种，收集细胞后将细胞用冻存液90％FBS，10％DMSO重悬，将冻存管放入液氮罐中保存。实验结果倒置相差显微镜下观察细胞贴壁生长，图1为倒置相差显微镜下第三代骨肉瘤细胞。观察结果及图1表明：该细胞株的细胞有重叠生长的能力，细胞成多角形，核大，胞浆相对较少，核仁1-2个，细胞异型性明显。电镜观察体外培养的骨肉瘤细胞株，图2为骨肉瘤细胞株细胞投射电镜图片。电镜观察见体外培养的细胞核大，具有异质性，核仁明显，染色质分散，稍聚于核膜，核膜有皱褶状凹陷，胞浆较少，含有较多的线粒体和溶酶体，线粒体肿大且形状不一，含有丰富的粗面内质网，囊池有不同程度的膨胀，胞浆内含有丰富的游离核糖体，细胞排列紧密，表面微绒毛发达如图2所示，具有骨肉瘤细胞的形态特征。实施例2人原代骨肉瘤细胞株生长周期收集对数生长期的细胞1×106，用300μl的PBS重悬细胞，将细胞逐滴加入700μl预冷的无水乙醇中，4℃避光固定过夜，800g离心10min，去上清，PBS清洗两次，重悬细胞于500μl含100umlRNaseA的PBS缓冲液中，避光37℃孵育30min，加2mgmlPI至终浓度50μgml，避光孵育30min，以PI荧光读数为横坐标，细胞数为纵坐标，在流式细胞仪上计数细胞周期各期的细胞数目。实验结果：图3为人原代骨肉瘤细胞株细胞生长周期，由图3可知，流式细胞仪测定出细胞G1＝42.9％，G2＝9.69％，S＝47.42％。实施例3细胞增殖实验本实验采用CCK8法，操作步骤如下：将处于对数生长期的细胞按5000个200μl的浓度接种于96孔板，每孔设5个对照，共培养7天，分别于第1天、第2天、第4天和第7天，于每孔中加入CCK820μl，共同温育3.5h；然后用水平摇床摇匀，以使Formazane充分溶解；用自动酶标仪在450nm波长处，测定各孔的AOD值，取其平均值描记各细胞的生长曲线，此实验重复3次，得到细胞生长曲线如图4所示。实验结果：本实施例建系的骨肉瘤细胞生长迅速，细胞值由1×104迅速增殖到第8天的7.8×104，平均倍增时间为48h。实施例4染色体分析当细胞处于对数生长期时，往培养基中加入1×10-5M秋水仙素，处理6h时后，收集细胞，在低渗液0.04MKCl，0.025MNaCl中悬浮细胞，37℃放置20min后加入甲醇冰醋酸3：1固定液1ml，固定20min，1000rpm离心10分钟后去上清，再加入新鲜甲醇冰醋酸3：1固定，吹打混匀，离心1000rpm10min收集细胞。加入0.2ml醋酸甲醇，分散细胞，取一滴细胞悬液到预冷的载玻片上，同时用洗耳球吹散细胞液，使其分散到玻片上。Giemsa染色后在显微镜下观察，观察结果如图5所示。实验结果由观察结果及图5可知，移植瘤经过连续传代后，其染色体保持人类肿瘤染色体的特点，主要为亚三倍体细胞，染色体众数集中在61-65之间。实施例5体外侵袭与迁移实验将Transwell置于24孔细胞培养板中，加入40μl血管基膜类似物Matrigel稀释液，置于37℃细胞培养中凝固约4h；用胰酶消化细胞，调整细胞悬液密度，将细胞悬液0.1ml1×105个细胞分别加入Matrigel铺板上室基底的Transwell中，然后将Transwell转移至含有0.6ml完全培养液的24孔板中，在37℃、CO2体积分数为5％的条件下培养22-24h；从细胞培养板中取出Transwell，用棉棒拭去上室内未侵袭穿膜的细胞，甲醇固定Transwell底膜并贴壁的细胞，苏木精-伊红染色，每张膜选取3个不重复视野，光学显微镜下计数，实验重复2次。实验结果在相差显微镜下，计数穿过Matrigel层的细胞数目。每个标本数10个视野，每个视野面积约为0.44mm2，计算1cm2面积内穿过的细胞数目，求出该数以10为底的对数值，即为此种细胞亚系的侵袭指数。图6为显微镜下本发明建立的骨肉瘤细胞、MNNGHOS和MG63细胞浸润到绿滤膜背面的细胞照片，图7为本发明建立的骨肉瘤细胞、MNNGHOS和MG63细胞迁移到滤膜背面的细胞照片。由计算的侵袭指数和迁移指数以及图6-图7可知，本发明建立的骨肉瘤细胞与其它骨肉瘤细胞系具备同样强的侵袭和迁移能力。实施例6裸鼠致瘤实验4周龄雄性裸鼠购自中国人民解放军第二军医大学动物中心，实验方案经过中国人民解放军第二军医大学动物实验伦理委员会审核批准。收取第5代、10代、15代、20代、35代5×106个本发明建立的骨肉瘤细胞，将其重悬于20μlDMEM和Matrigel基质胶1：1中备用。用手术刀在裸鼠胫骨结节前方沿胫骨做一2mm的竖切口，分开皮下组织后，用10号皮试针从胫骨结节斜刺入胫骨骨髓腔中，扩髓后抽出，用微量进样器将20μl制备好的骨肉瘤细胞悬液缓慢注入胫骨骨髓腔中后缓慢抽出，10号可吸收缝线缝合皮肤。对侧胫骨骨髓腔注射等量的不含细胞的DMEM和Matrigel基质胶作为对照。第2周开始，用X光机进行胫骨X光检测，以后每周检测一次。第4-6周将X光显示胫骨明显骨破坏的裸鼠处死，将致瘤的胫骨取出，甲醛固定、15％EDTA-2Na脱钙进行HE染色及免疫组化。实验结果裸鼠进行本发明建立的骨肉瘤细胞皮下注射后，均无意外死亡，无切口感染，进食睡眠良好。术后平均第30d可见明显皮下包块，取出皮下肿瘤后HE染色结果显示如图8-9所示：组织内有密集成群的未分化上皮细胞，细胞排列紊乱，异形性明显，核大深染，核内染色质数目不均。实施例7荧光素酶基因过表达稳定细胞株NEO217-luc构建1、质粒构建：PCDHcatalognumberCD510B-1,SystemBiosciences质粒用EcoRI和BamHI两个酶进行酶切，luciferase片段由PCR扩增获得1653bp左右的片段引物F：CGGAATTCCGatggaagacgccaaaaacat；引物R：CGGGATCCCGTTACACGGCGATCTTTCCGC；酶切产物进行电泳及胶回收；将luciferase片段与线性化的载体片段用连接酶TAKARA进行连接；转化、挑取单克隆、质粒抽提；Sanger测序，正确的重组质粒命名为PCDH-luc。2、病毒包装：转染前一天在6cm培养皿中种HEK-293T细胞，转染时细胞密度约为80％-90％。采用三质粒包装系统：载体PCDH-luc4ug，PackagingplasmidpsPAX23.6ug、EnvelopeplasmidPMD2.G1.2ug。将这些质粒加入到500uL的Opti-MEM中，20uL转染试剂lipofectamine2,000也加入到500uL的Opti-MEM中，混匀后室温放置5min，然后将质粒与lipofectamine2,000混合，室温放置20min。将混合物加入HEK-293T细胞中，6小时后，更换为新鲜的完全培养液。48h后，收集病毒并用0.45um滤膜过滤。3、细胞感染转染前一天将NEO217细胞接种于6孔板中，感染前细胞密度约为30％-40％。于每个孔中加入2uLPolybrene6ugmL，37℃，5％CO2培养30min，然后将病毒加入NEO217细胞中。感染8h后更换新鲜的完全培养基。感染48h后每个孔中加入2uLpuromycin4ugmL进行筛选，提高感染效率。实验结果将上述细胞扩大培养，即为荧光素酶基因稳定过表达的细胞株NEO217-luc，可用于体内示踪及监测细胞在体内的生长情况。综上所述，根据建系标准，本发明构建的NEO217-luc细胞株具有人原代骨肉瘤肿瘤细胞的特性，符合建系标准，是一株新建的人骨肉瘤肿瘤细胞系，可作为骨肉瘤发病机制及个体化治疗体外研究的细胞材料，进而为建立骨肉瘤发生机理模型及制备、筛选、评价抗肿瘤药物提供基础。以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅限制于本文所示的实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干修改和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种来源于脊柱的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc，其特征在于，所述细胞株NEO217-luc保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉市武汉大学，保藏日：2018.10.24，保藏号为CCTCCNO：C2018179。2.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc的构建方法，包括如下步骤：1将脊柱骨肉瘤患者手术切除后的无菌新鲜肿瘤标本用Hanks液反复冲洗，去除标本表面粘附的红细胞，用无菌组织剪将肿瘤标本反复剪切至糜状，移入装有10mlDMEM培养基的无菌离心管中，加入II型胶原酶10μl，同时加入青霉素、链霉素，放入恒温振荡仪中在37℃下以200次min的速度进行振荡，振荡2小时后取出、用巴氏吸管将其吹打混匀，将组织悬液用400目无菌金属筛网中过筛，收集过筛后的液体，用巴氏吸管紧贴离心管将收集的液体缓慢加入到预盛5mlFicoll淋巴细胞分离液的无菌离心管中，放入离心机中2500转min、离心30min；离心完毕后收集中间的细胞层，PBS对吸出的细胞层吹打、重悬，再次离心，去上清后底部即为分离所得的组织细胞；2将步骤1处理获得的组织细胞接种于细胞培养瓶中，加入DMEM培养基，将细胞培养瓶放置在温度设定为37℃、CO2浓度为5％的细胞培养箱中进行培养；培养第3天进行半量换液一次，第5天进行全量换液一次，第7天用含有0.02％EDTA的0.25％胰酶将贴壁细胞消化后进行1：2传代；3将传代的细胞接种于新的细胞培养瓶中，加入含有DMEM培养基进行培养；在培养的过程中，挑选不同代数的细胞进行冻存保种，收集细胞后将细胞用冻存液重悬，将冻存管放入液氮罐中保存，将该细胞系命名为NEO217；4将荧光素酶基因整合到细胞NEO217染色体DNA上，使细胞表达荧光素酶，构建出稳定表达荧光素酶的细胞株，命名为NEO217-luc，得保藏编号为CCTCCNO：C2018179的人原代骨肉瘤细胞株。3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤1中，所述青霉素浓度为100Uml，所述链霉素浓度为100mgml。4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤2中，所述DMEM培养基含有20％胎牛血清、100Uml青霉素、100mgml链霉素。5.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述DMEM培养基含有10％胎牛血清、100Uml青霉素、100mgml链霉素。6.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc在建立体外的人脊柱骨肉瘤动物模型中的应用。7.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc在建立人脊柱骨肉瘤发生机理模型中的应用。8.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc在制备抗人脊柱骨肉瘤药物中的应用。9.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc在筛选抗人脊柱骨肉瘤药物中的应用。10.如权利要求1所述的人原代骨肉瘤细胞株NEO217-luc在评价抗人脊柱肿瘤药物中的应用。

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