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申请/专利权人：东莞市第八人民医院(东莞市儿童医院);东莞市儿科研究所

摘要：本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测SENP2mRNA水平的引物、探针和试剂盒，所述引物包括用于扩增SENP2基因的引物F1和引物R1、以及用于扩增对照基因GADPH的引物F2和引物R2。所述探针包括用于检测SENP2基因的探针P1和用于检测对照基因GAPDH的探针P2。所述试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。本发明的引物和探针特异性好，检测灵敏精确。本发明的试剂盒使用FAM和VIC双通道可对SENP2mRNA的表达进行准确的定量分析，具有快速、简便、灵敏度高等检测优点。

主权项：1.一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR引物，其特征在于：所述引物包括用于扩增SENP2基因的引物F1和引物R1、以及用于扩增对照基因GADPH的引物F2和引物R2，所述4条引物的核苷酸序列分别为：F1：5’-GGACACTGATGAAATACCAG-3'R1：5’-CCGTGTTCCATTACAAGCAG-3'F2：5’-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAGA-3'R2：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。

全文数据：一种用于定量检测SENP2mRNA水平的引物、探针和试剂盒技术领域本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种用于定量检测SENP2mRNA水平的引物、探针和试剂盒。背景技术病毒性心肌炎（viralmyocarditis，VMC）是由病毒引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变。近年来病毒性心肌炎在我国的发病呈上升趋势，已成为儿童和青少年猝死的主要原因之一。部分患者呈自限性病程，重者可出现心力衰竭、心源性休克和猝死，部分患者可演变为扩张型心肌病，致死率高达50%。病毒性心肌炎已成为我国亟需解决的重大公共卫生问题。目前对病毒性心肌炎的临床检测主要集中在心肌损伤后释放在血清中的心肌酶CK和CK-MB的改变，以及心电图的动态监测。而临床发现，心肌酶检测往往缺乏与病毒性心肌炎的正相关性，有时不能反映心肌炎患者的实际情况。因此，寻找有效的病毒性心肌炎的识别标志物，是降低该病死亡率的关键。SENP2是半胱氨酸蛋白酶家族成员，由589个氨基酸残基构成，是蛋白质SUMO化修饰的主要蛋白酶。我们前期研究发现，SENP2条件性敲除小鼠出现胚胎心脏发育的缺陷，研究结果表明SENP2对心肌细胞的发育具有重要作用。肠道病毒属的柯萨奇病毒A组、柯萨奇病毒B组、艾可病毒、脊髓灰质炎病毒等为常见的致心肌炎病毒，其中柯萨奇B组3型（CVB3）是最主要的病毒。我们研究发现，经CVB3感染导致的病毒性心肌炎小鼠中，心脏中SENP2的mRNA水平和蛋白水平都显著升高（实验结果如图4A、B所示）。同时，在心肌炎病理切片HE染色和免疫组化结果显示，心脏出现大量炎症细胞浸润，而且在炎症细胞中出现大量SENP2蛋白的高表达（实验结果如图5A、B所示）。因此，SENP2在病毒性心肌炎中与炎症程度呈正相关，可以作为病毒性心肌炎识别诊断的分子标志物。本发明将使用荧光定量PCR技术，在mRNA水平检测SENP2表达情况，为病毒性心肌炎的诊断提供准确、快速、高效、敏感的检测方法。发明内容为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR引物，该引物特异性好，检测灵敏精确。本发明的另一个目的在于提供一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR探针，该探针特异性好，检测灵敏精确。本发明的还一个目的在于提供一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，该试剂盒使用FAM和VIC双通道可对SENP2mRNA的表达进行准确的定量分析，具有快速、简便、灵敏度高等检测优点。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR引物，所述引物包括用于扩增SENP2基因的引物F1和引物R1、以及用于扩增对照基因GADPH的引物F2和引物R2，所述4条引物的核苷酸序列分别为：F1：5’-GGACACTGATGAAATACCAG-3'R1：5’-CCGTGTTCCATTACAAGCAG-3'F2：5’-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAGA-3'R2：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。本发明的另一个目的通过下述技术方案实现：一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR探针，所述探针包括用于检测SENP2基因的探针P1和用于检测对照基因GAPDH的探针P2，所述探针的核苷酸序列分别为：P1：5’-TCTCTACAATGCTGCCAGCT-3'P2：5’-TGGTGAAGCAGGCGGCCGAG-3'；其中，所述探针P1和探针P2的5’端均标记荧光基团，3’端均标记淬灭基团。优选的，所述探针P1的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA。优选的，所述探针P2的5’端标记荧光基团VIC，3’端标记淬灭基团TAMRA。本发明的还一个目的通过下述技术方案实现：一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，所述试剂盒包括上述所述的引物和上述所述的探针。优选的，所述试剂盒由2×NASBA反应液、5×NASBA反应酶混合液、标准品、阳性质控品及阴性质控品组成。优选的，所述2×RT-PCR反应液包括如下具体成分：50mMTris-HCl（pH8.3）、100mMKCl、10mMMgCl2、1.0%TritonX-100、0.5mMdNTP、引物F1和引物R1各1μmolL、引物F2和引物R2各1μmolL、P1探针0.5μmolL和P2探针0.4μmolL。优选的，所述5×RT-PCR反应酶混合液包括4UmLTaq酶、1.6UμLMMLV反转录酶、3UμLRNA酶抑制剂和30mgmLBSA。优选的，所述标准品为含有标准品序列的重组pUC57质粒，所述标准品序列为：GGACACTGATGAAATACCAGCCAAAAGACCAAGATTAGATTGCTTTATTCACCAAGTGAAAAACAGTCTCTACAATGCTGCCAGCTTATTTGGATTCCCATTCCAGCTGACCACAAAGCCCATGGTAACTTCTGCTTGTAATGGAACACGG。优选的，所述阳性质控品为含有SENP2mRNA的细胞裂解液样品，阴性质控品为无RNA酶的DEPC-H2O。本发明的有益效果在于：本发明的引物和探针特异性好，检测灵敏精确。本发明的试剂盒使用FAM和VIC双通道可对SENP2mRNA的表达进行准确的定量分析，具有快速、简便、灵敏度高等检测优点。附图说明图1为标准品的荧光定量PCR检测结果。图2为标准品的荧光定量PCR检测的标准曲线。图3为42例临床病例SENP2基因扩增曲线。图4为CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏中CVB3病毒载量检测及SENP2mRNA水平检测。其中，A：CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏中CVB3病毒载量检测；B:CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏中SENP2mRNA水平检测。RpL35A为小鼠cDNA上样内参。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001，vsControln=5。图5为CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏组织HE染色结果及免疫组化检测SENP2蛋白分布及表达情况。其中，A：CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏组织HE染色结果；B：CVB3感染C57BL6J小鼠一周后心脏组织免疫组化检测SENP2蛋白分布及表达情况。密集区域代表SENP2的表达水平，颜色越深表示SENP2表达越多。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。实施例1试剂盒的设计和组成本发明的试剂盒由2×NASBA反应液、5×NASBA反应酶混合液、标准品、阳性质控品及阴性质控品组成。1、引物和探针的设计和合成：从GenBank中找出SENP2和GAPDH的保守基因序列，采用PrimerPrimier5.0软件分别设计扩增引物和探针序列，确保每一对引物能够特异性扩增出SENP2和GAPDH。用于扩增SENP2基因的引物F1和引物R1，以及用于扩增对照基因GADPH的引物F2和引物R2的核苷酸序列分别为：F1：5’-GGACACTGATGAAATACCAG-3'R1：5’-CCGTGTTCCATTACAAGCAG-3'F2：5’-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAGA-3'R2：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。用于检测SENP2基因的探针P1和用于检测对照基因GAPDH的探针P2的核苷酸序列分别为：P1：5’-TCTCTACAATGCTGCCAGCT-3'P2：5’-TGGTGAAGCAGGCGGCCGAG-3'。其中，探针P1的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA；所述探针P2的5’端标记荧光基团VIC，3’端标记淬灭基团TAMRA。2、反应液及反应酶混合液的配制：所述2×NASBA反应液及5×NASBA反应酶混合液根据优化试验，确定为如下具体最优配方：50mMTris-HCl（pH8.3）、100mMKCl、10mMMgCl2、1.0%TritonX-100、0.5mMdNTP、引物F1和引物R1各1μmolL、引物F2和引物R2各1μmolL、P1探针0.5μmolL和P2探针0.4μmolL；5×RT-PCR反应酶混合液包括4UmLTaq酶、1.6UμLMMLV反转录酶、3UμLRNA酶抑制剂和30mgmLBSA。3、标准品标准品为终浓度为1×108copiesmL的含有标准品序列的重组pUC57质粒，TE溶液溶解（TE溶液的组成为10mmolL三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐、1mmolL乙二胺四乙酸和水）。重组pUC57质粒插入的标准品序列为：GGACACTGATGAAATACCAGCCAAAAGACCAAGATTAGATTGCTTTATTCACCAAGTGAAAAACAGTCTCTACAATGCTGCCAGCTTATTTGGATTCCCATTCCAGCTGACCACAAAGCCCATGGTAACTTCTGCTTGTAATGGAACACGG。4、阳性质控品和阴性质控品阳性质控品为含有SENP2mRNA的细胞裂解液样品，阴性质控品为无RNA酶的DEPC-H2O。实施例2标准曲线的制备反应液配制：2×NASBA反应液为10µL×n，5×RT-PCR反应酶混合液为4µL×n，DEPC-H2O为2µL×n。将各组分混匀，每管16µL分装到八连管中（n为反应管数）。标准品的梯度稀释：将标准品溶液采用10倍梯度稀释的方法，依次稀释为1×107copiesmL、1×106copiesmL、1×105copiesmL和1×104copiesmL。标准曲线的制作：取4µL各浓度的标准品稀释液，加入至已装有16µL的反应液中，在罗氏公司的LightCycler480定量PCR仪上进行PCR扩增。PCR反应条件为：50℃，15min→95℃，3min→（95℃，15s→55℃，30s，72℃，30s）。PCR扩增步骤共进行40个循环。根据标准品的荧光定量PCR检测结果（图1）绘制标准曲线，标准曲线如图2所示。横坐标为X，代表标准品起始拷贝数的对数值（Log10），纵坐标为Y，代表Ct值。标准曲线的方程为Y=-3.74X+52.37，相关系数为0.9994。本发明的试剂盒使用FAM和VIC双通道可对SENP2mRNA的表达进行准确的定量分析，具有快速、简便、灵敏度高等检测优点。上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR引物，其特征在于：所述引物包括用于扩增SENP2基因的引物F1和引物R1、以及用于扩增对照基因GADPH的引物F2和引物R2，所述4条引物的核苷酸序列分别为：F1：5’-GGACACTGATGAAATACCAG-3'R1：5’-CCGTGTTCCATTACAAGCAG-3'F2：5’-CCTGCCAAGTATGATGACATCAAGA-3'R2：5’-GTAGCCCAGGATGCCCTTTAGT-3'。2.一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR探针，其特征在于：所述探针包括用于检测SENP2基因的探针P1和用于检测对照基因GAPDH的探针P2，所述探针的核苷酸序列分别为：P1：5’-TCTCTACAATGCTGCCAGCT-3'P2：5’-TGGTGAAGCAGGCGGCCGAG-3'；其中，所述探针P1和探针P2的5’端均标记荧光基团，3’端均标记淬灭基团。3.根据权利要求2所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR探针，其特征在于：所述探针P1的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记淬灭基团TAMRA。4.根据权利要求2所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR探针，其特征在于：所述探针P2的5’端标记荧光基团VIC，3’端标记淬灭基团TAMRA。5.一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和权利要求2-4任一项所述的探针。6.根据权利要求5所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由2×NASBA反应液、5×NASBA反应酶混合液、标准品、阳性质控品及阴性质控品组成。7.根据权利要求6所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述2×RT-PCR反应液包括如下具体成分：50mMTris-HCl（pH8.3）、100mMKCl、10mMMgCl2、1.0%TritonX-100、0.5mMdNTP、引物F1和引物R1各1μmolL、引物F2和引物R2各1μmolL、P1探针0.5μmolL和P2探针0.4μmolL。8.根据权利要求6所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述5×RT-PCR反应酶混合液包括4UmLTaq酶、1.6UμLMMLV反转录酶、3UμLRNA酶抑制剂和30mgmLBSA。9.根据权利要求6所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述标准品为含有标准品序列的重组pUC57质粒，所述标准品序列为：GGACACTGATGAAATACCAGCCAAAAGACCAAGATTAGATTGCTTTATTCACCAAGTGAAAAACAGTCTCTACAATGCTGCCAGCTTATTTGGATTCCCATTCCAGCTGACCACAAAGCCCATGGTAACTTCTGCTTGTAATGGAACACGG。10.根据权利要求6所述的一种用于定量检测SENP2mRNA水平的PCR试剂盒，其特征在于：所述阳性质控品为含有SENP2mRNA的细胞裂解液样品，阴性质控品为无RNA酶的DEPC-H2O。

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