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申请/专利权人：华南理工大学

摘要：本发明属于基因工程和生物制药领域，公开了一种Brevinin‑2GUb多肽的重组表达方法，包括：1将Brevinin‑2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、组蛋白标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中获得重组表达载体；2将重组表达载体转化至大肠杆菌获得重组表达工程菌株；3将工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体、破碎，离心获得上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；4将融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析后浓缩，获得不带标签的目的多肽。该多肽在低浓度下即可对INS‑1细胞具有显著促胰岛素分泌活性，可用于制备降糖多肽药物。

主权项：1.一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法，其特征在于，包括如下步骤：1将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中，得到重组表达载体；2将步骤1中得到的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组表达工程菌株；3将步骤2中得到的工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后再次离心收集上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；4将步骤3得到的融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对透析后的融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析，获得不带标签的高纯度Brevinin-2GUb多肽。

全文数据：一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用技术领域本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用。背景技术近几十年来，全球成年人糖尿病的患病率持续上升OgurtsovaK.IDFDiabetesAtlas:Globalestimatesfortheprevalenceofdiabetesfor2015and2040[J].DiabetesResearchandClinicalPractice,2017,128:40-50。随着经济发展和人们生活水平的提高，糖尿病已经成为全世界范围内最常见的慢性病之一。根据国际糖尿病联合会IDF估计，2017年全球有4.51亿18-99岁糖尿病患者，预计到2045年，糖尿病患者数量将增至6.93亿ChoNH.IDFDiabetesAtlas:Globalestimatesofdiabetesprevalencefor2017andprojectionsfor2045[J].DiabetesResearchandClinicalPractice,2018,138:271-281。在糖尿病患者中，有80％-90％属于II型糖尿病患者。由于目前临床治疗II型糖尿病的药物如磺酰脲类、二甲双胍类和格列奈类等疗效有限，且会出现耐受性和毒副作用，因此开发能够调节糖代谢并显著降低毒副作用的生物活性多肽用于治疗糖尿病成为国内外的研究热点。蛙皮素多肽Brevinin-2GUb是在2008年从亚洲青蛙Hylaranaguntheri的皮肤分泌物中分离出来的抗菌肽，属于Brevinin-2家族，由30个氨基酸所构成，是一种两亲性的阳离子多肽。已有研究表明，人工合成的Brevinin-2GUb在浓度为100nM时，可以显著增加BRIN-BD11细胞释放胰岛素的速度ConlonJM.Apotent,non-toxicinsulin-releasingpeptideisolatedfromanextractoftheskinoftheAsianfrog,HylaranaguntheriAnura:Ranidae[J].RegulatoryPeptides,2008,151:153-159。此外，人工合成的Brevinin-2GUb能够显著促进正常大鼠的胰岛素分泌，但对体重、血糖没有显著影响；糖尿病大鼠组中，注射Brevinin-2GUb后，大鼠的体重显著上升、胰岛素水平均有明显升高，血糖明显降低周庆峰.蛙皮抗菌肽Brevinin-2Gub对2型糖尿病大鼠体重、血糖和胰岛素水平的影响[J].中国老年学杂志,2013,33:5904-5906。因此，Brevinin-2GUb多肽在治疗II型糖尿病方面具有良好的应用前景。由于从蛙类皮肤分泌物中分离纯化Brevinin-2GUb的程序复杂，产量很低，且提取难度大；人工合成具有生物活性的多肽是快速获得多肽的另一种重要手段，但人工合成成本高，每个氨基酸大约200元左右。大肠杆菌是表达异源重组蛋白应用最为广泛的宿主之一，大肠杆菌表达系统具有表达蛋白高效、发酵条件易控制、表达成本低等优势。因此用基因工程的生物方法在大肠杆菌表达系统中实现Brevinin-2GUb的重组表达并研究其对INS-1细胞的促胰岛素分泌活性，在其用于制备降糖多肽药物方面具有重大的理论意义和经济效益。发明内容本发明的目的之一在于提供一种Brevinin-2GUb多肽重组表达载体的构建方法，本发明的目的之二在于提供一种利用肠激酶的切割特异性实现不带标签的Brevinin-2GUb多肽的重组表达纯化方法，所得到的Brevinin-2GUb多肽对INS-1细胞具有显著的促胰岛素分泌活性。本发明具体技术方案如下：一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法，包括如下步骤：1将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中，得到重组表达载体；2将步骤1中得到的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组表达工程菌株；3将步骤2中得到的工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后再次离心收集上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；4将步骤3得到的融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对透析后的融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析后浓缩，获得不带标签的高纯度Brevinin-2GUb多肽。优选地，步骤1中所述Brevinin-2GUb的核苷酸序列为SEQIDNo.1。优选地，步骤1所述重组表达载体的构建如下：以合成的含有Brevinin-2GUb基因的质粒为模板，以Bre-FR为引物对通过PCR技术扩增得到Brevinin-2GUb基因，并通过RF克隆将Brevinin-2GUb和pET32系列载体连接，构建出重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb。优选地，所述Bre-FR的序列如下：Bre-F：5'-ACGACGACGACAAGGCCATGGGTGTTATTATTGATACTCTGAAAG-3'，其核苷酸序列为SEQIDNo.2；Bre-R：5'-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCAAGAGTTGGTGCAGTTTGCAGTG-3'，其核苷酸序列为SEQIDNo.3；优选地，步骤3所述诱导表达的条件为：12～40℃诱导表达5～25h，诱导剂为IPTG异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，浓度为0.1～2mM。优选地，所述诱导表达的条件为：16±2℃诱导表达20±2h，所述IPTG浓度为1mM。优选地，步骤4所述肠激酶酶切的条件为：在4℃～30℃条件下，肠激酶的用量为1Umg～3Umg融合蛋白，酶切时间为12-36h。优选地，所述肠激酶酶切的条件为：25℃下，2Umg肠激酶酶切融合蛋白24h。优选地，步骤4所述浓缩方式为聚乙二醇20000浓缩、蔗糖浓缩或者超滤管3kDa浓缩。优选地，所述浓缩方式为超滤管3kDa浓缩。优选地，步骤1中所述pET32系列载体为pET32a、pET32b、pET32c载体。优选地，步骤2所述大肠杆菌为BL21、BL21DE3、BL21DE3pLysS或BL21DE3Rosetta系列。上述方法制备的Brevinin-2GUb多肽在制备降糖口服液及多肽药物中的应用。与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：1、蛋白产量高，表达纯化简单，成本低廉。目前Brevinin-2GUb主要通过提取分离和人工合成的方法来制备，但提取分离过程复杂，难度大产量小；人工合成则成本高。本发明首次通过基因工程的方法利用蛋白酶的切割特异性成功实现不带任何标签的Brevinin-2GUb的重组表达，Brevinin-2GUb多肽产量约为2.5mgL，纯度为90％以上。2、该多肽具有显著的促胰岛素分泌活性，从而调节体内血糖。本发明重组表达获得的不带任何标签的Brevinin-2GUb多肽在低浓度下10μgmL即可对INS-1细胞具有显著促胰岛素分泌活性，从而调节体内血糖，可用于制备降糖多肽药物。附图说明图1为重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb的设计及蛋白切割示意图；其中，A为重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb的设计示意图，B为Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白切割示意图。图2为pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb载体构建菌落PCR图。其中泳道M：DNAMarker；泳道1-5：阳性克隆。图3为含有pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb的E.coliBL21DE3重组表达菌株的小量表达及对诱导表达温度进行优化结果图。其中泳道M：蛋白MarkerW:全液；S:上清；P:沉淀；No:没有诱导；IPTG:1mMIPTG诱导，16℃、25℃、37℃分别诱导表达20h、12h、5h。图4为Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的大量表达及纯化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；S：Trx-His-EK-Brevinin-2GUb全液样品；FF：穿过液；1、2：50mM咪唑洗脱液；3、4：100mM咪唑洗脱液；5、6：150mM咪唑洗脱液；7、8：250mM咪唑洗脱液；9、10：500mM咪唑洗脱液。图5为Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的肠激酶酶切及纯化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；1：Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白；2：肠激酶酶切融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb后样品；FF：对肠激酶酶切融合蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb后样品进行镍离子亲和层析时的穿过液；ET：500mM咪唑洗脱液3：超滤管浓缩后的Brevinin-2GUb。图6为浓缩后的Brevinin-2GUb多肽的蛋白浓度测定结果图。其中1：浓缩后的Brevinin-2GUb多肽，2-5：浓度分别为2.5，2.0，1.5，1.0μg孔人工合成的Brevinin-2GUb，M：蛋白marker。图7为胰岛素含量的标准曲线图。图8为Brevinin-2GUb对INS-1细胞的促胰岛素分泌作用检测图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。实施例1：重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb的构建1根据Brevinin-2GUb的基因序列，在基因合成公司上海生工合成其DNA序列，设计如下引物Bre-FBre-R扩增Brevinin-2GUb目的基因：2以合成的含有Brevinin-2GUb基因的质粒pUC57-Brevinin-2GUb为模板，用上述扩增引物进行Brevinin-2GUb目的基因的扩增，具体步骤如下：a.PCR反应体系50μL：b.PCR扩增反应程序：3PCR反应结束后，进行2％wv琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小约为133bp的包含Brevinin-2GUb的基因片段，对PCR产物进行纯化回收，得到含有Brevinin-2GUb的基因片段，然后配制线性扩增反应体系，将回收的Brevinin-2GUb目的基因插入载体pET32a中，具体反应体系如下：a.PCR反应体系50μL：b.PCR扩增反应程序：4PCR反应完后，将步骤3中得到的PCR产物进行DpnI酶切消化，具体操作如下：a.酶切反应体系20μL：b.置于37℃恒温PCR仪中反应1h。5将酶切后产物转化到E.coliDH5α感受态细胞中，挑选平板上单克隆进行菌落PCR检验，体系如下：6菌落PCR反应结束后，进行1％wv琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：如图2所示，对条带大小正确约为750bp的单克隆1、2号进行测序鉴定，测序表明单克隆1、2号测序正确，重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb构建成功。实施例2：Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的表达及优化1将实施例1中构建的重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21DE3感受态细胞中，挑取转化平板上单克隆接种至6mL的氨苄抗性的LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。将种子液按1:100vv的比例接种到6支含有6mL新鲜氨苄抗性LB液体培养基的试管中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD600＝0.6～0.8时，3支添加1mMIPTG进行诱导，另外3支不添加诱导剂IPTG作为对照，取1支诱导，1支未诱导共三组分别于16℃、25℃、37℃诱导表达20h、12h、5h进行表达温度优化。2诱导表达结束后，对表达后的菌液测定OD600并进行收菌。按照每10OD加1mLPBSbuffer对上述收集的菌体完全悬浮，然后采用超声波破碎菌体。菌体破碎完毕后吸取80μL制备破碎后的全液样品，然后12000rpm离心2min获得破碎后的上清和沉淀，分别吸取80μL制备破碎后的上清和沉淀样品。3将80μL样品和上样缓冲液混合后置于沸水浴中煮沸10min，12000rpm离心2min，跑SDS-PAGE电泳。结果：如图3所示，菌体经诱导后都有明显的目的蛋白条带21kDa，黑色箭头所指，说明Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白成功在大肠杆菌胞内表达。在16℃表达20h的条件下Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的产量最高。因此Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白诱导表达的最优温度为16℃。实施例3：Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的大量表达及镍离子亲和层析纯化1将实施例2中单克隆接种至8mL的LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。将种子液按1:100vv的比例接种到600mL新鲜氨苄抗性的LB液体培养基中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD600＝0.6～0.8时，添加诱导剂IPTG至终浓度为1mM,然后置于16℃的摇床中诱导表达20h。2表达结束后，6000rpm离心10min收集菌体，用纯化BufferA20mMTris，500mMNaCl，20％甘油，20mM咪唑，pH8.5重悬，高压破碎菌体后离心收集上清液，然后进行镍离子亲和层析纯化，收集穿过液样品和纯化前后样品进行SDS-PAGE检测。结果：如图4所示，重组蛋白Trx-His-EK-Brevinin-2GUb纯化成功，均能被250、500mM咪唑洗脱下来，并且蛋白分子量与理论大小一致21kDa，纯化后融合蛋白浓度为330μgmL。实施例4：Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的肠激酶酶切及镍离子亲和层析纯化1将实施例3中得到的Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白置于2L肠激酶酶切缓冲液【20mMTris，50mMNaCl，3MmGSH还原型谷胱甘肽，1mMGSSG氧化型谷胱甘肽，pH8.0】中透析24h后，按照每mg融合蛋白加入2U肠激酶的用量在25℃进行酶切24h。2将得到的肠激酶酶切后的融合蛋白进行镍离子亲和层析纯化，Trx-His-EK融合蛋白重新结合到镍柱上，Brevinin-2GUb多肽从穿过液中流出，收集含有Brevinin-2GUb多肽的穿过液。3将含有Brevinin-2GUb多肽的穿过液进行使用3kDa超滤管浓缩并用PBS缓冲液进行透析放置于4℃用于蛋白质定量活性检测。4将浓缩后的Brevinin-2GUb多肽与浓度分别为2.5，2.0，1.5，1.0μg孔的人工合成的Brevinin-2GUb进行Tricine-SDS-PAGE电泳，通过灰度扫描分析浓缩后的Brevinin-2GUb的浓度。结果：a.如图5所示，Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白的肠激酶酶切纯化成功，Trx-His-EK重新结合到镍柱上，再被500mM咪唑洗脱下来，Brevinin-2GUb从穿透液中流出并被收集黑色箭头所指，并且Brevinin-2GUb分子量大小与理论大小一致3.2kDa。b.如图6所示，通过使用ImageJ软件进行灰度扫描分析后，得到浓缩后的Brevinin-2GUb的浓度约为170μgmL。实施例5：Brevinin-2GUb多肽对INS-1细胞的促胰岛素分泌作用检测1从液氮罐中取出INS-1细胞，迅速置于37℃恒温水浴锅中轻轻摇晃直至细胞解冻融化，再在超净工作台中将其加入到含有3mL1640完全培养基10％胎牛血清，1％双抗含100UmL青霉素和100μgmL链霉素，0.11gL丙酮酸钠溶液，50μΜβ-巯基乙醇，1×1640含谷氨酰胺培养基定容的15mL离心管，室温下1000rpm离心3min。离心结束后，尽量弃去上清液，加入1mL1640完全培养基轻轻地将细胞重悬均匀，然后接种于培养皿中再加入2mL1640完全培养基混合均匀，在显微镜下观察细胞状态，将培养皿置于37℃，5％CO2培养箱中培养。2当INS-1细胞生长到合适的密度时，在超净台中弃去培养皿中的培养基，用3mLPBS缓冲液清洗3次。向清洗后的培养皿加入滴加1mL0.25％的胰酶，置于37℃培养箱静置1-3min，加入2mL1640完全培养基终止消化。将细胞吹打混合均匀后将细胞转移到15mL的离心管中，室温下1000rpm离心2min。离心结束后尽量弃去上清液，加入1mL1640完全培养基缓慢地将细胞重悬混合均匀。按1:3的比例将细胞接种于培养皿中，向培养皿中加入7mL1640完全培养基并将细胞混合均匀。将培养皿置于37℃，5％CO2培养箱中培养。3当INS-1细胞生长到合适的密度时，在超净台中弃去培养皿中的培养基，用3mLPBS缓冲液清洗3次。向清洗后的培养皿加入滴加1mL0.25％的胰酶，置于37℃培养箱静置1-3min，加入2mL1640完全培养基终止消化。将细胞吹打混合均匀后将细胞转移到15mL的离心管中，室温下1000rpm离心2min。离心结束后尽量弃去上清液，加入1mL1640完全培养基缓慢地将细胞重悬混合均匀。将细胞悬浮液稀释10倍进行计数，即取出50μL混匀后的细胞悬浮液加入到含有450μL1640完全培养基的1.5mLEP管中，混合均匀后取10μL进行血球计数板计数法计数。4计数结束后以2×105cells孔在12孔板中接种细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养48h后从培养箱中取出12孔板，尽量除尽旧培养基，用PBS缓冲液清洗1次后，每孔加入1mL含有5.6mM葡萄糖和0.2％牛血清蛋白BSA的HBSS缓冲液37℃，5％CO2培养箱中培养1h。5用含有5.6mM葡萄糖和0.2％牛血清蛋白BSA的HBSS缓冲液将Brevinin-2GUb配制成10μgmL的工作浓度，以含有5.6mM葡萄糖和0.2％牛血清蛋白BSA的HBSS缓冲液处理细胞作为空白对照。6从培养箱中取出12孔板，尽量除尽孔内液体，每孔加入1mL配制好的工作液，每个样品3个复孔，37℃，5％CO2培养箱中培养1h。将细胞培养上清收集到1.5mLEP管中，1000rpm离心20min，除去杂质及细胞碎片，取上清使用大鼠胰岛素INS酶联免疫吸附测定试剂盒检测胰岛素含量。7将不同浓度5、2.5、1.25、0.63、0.31、0ngmL的标准品工作液和待测样品加入到酶标板孔中，每个样品三个复孔，每孔100μL，给酶标板覆膜，37℃培养箱中孵育90min。弃去酶标板中的液体，甩干酶标板，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃培养箱中温育1h。甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2min，尽量甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此步骤洗板3次。每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃培养箱中温育30min。弃去孔内液体，尽量甩干，洗板5次。每孔加90μL底物溶液TMB，酶标板加上覆膜37℃培养箱中避光孵育25min左右，提前打开酶标仪进行预热。用与底物溶液的加入顺序相同的顺序每孔加入终止液50μL，终止反应。立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度OD值。结果：a.如图7所示，以0ngmL的标准品工作液作为空白对照，绘制出胰岛素含量的标准曲线，其线性公式为Y＝0.2684X-0.0447，R2＝0.9976，说明胰岛素含量的标准曲线绘制成功，可用于后续实验测定胰岛素含量的计算。b.如图8所示，以含有5.6mM葡萄糖和0.2％牛血清蛋白BSA的HBSS缓冲液处理细胞作为空白对照，Brevinin-2GUb在10μgmL的低浓度下即可对INS-1细胞胰岛素的分泌具有显著P＜0.01的促进作用，其胰岛素分泌量为基础分泌量空白对照的120.04％。说明重组表达的Brevinin-2GUb具有显著的促胰岛素分泌活性，从而调节体内血糖，为Brevinin-2GUb多肽开发为降糖口服液及多肽药物奠定了基础。序列表华南理工大学一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法及应用3SIPOSequenceListing1.0190DNA人工序列ArtificialSequence1ggtgttattattgatactctgaaaggtgctgctaaaaccgttgctgctgaactgctgcgt60aaagctcactgcaaactgaccaactcttgc90245DNA人工序列ArtificialSequence2acgacgacgacaaggccatgggtgttattattgatactctgaaag45348DNA人工序列ArtificialSequence3gctttgttagcagccggatctcagcaagagttggtgcagtttgcagtg48

权利要求：1.一种Brevinin-2GUb多肽的重组表达方法，其特征在于，包括如下步骤：1将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的pET32系列载体中，得到重组表达载体；2将步骤1中得到的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到重组表达工程菌株；3将步骤2中得到的工程菌株进行诱导表达，离心收集菌体，破碎菌体后再次离心收集上清液，对上清液进行镍离子亲和层析获得融合蛋白；4将步骤3得到的融合蛋白用肠激酶酶切缓冲液透析，然后用肠激酶对透析后的融合蛋白进行切割，再进行镍离子亲和层析，获得不带标签的高纯度Brevinin-2GUb多肽。2.根据权利要求1所述的重组表达方法，其特征在于，步骤1中所述Brevinin-2GUb的核苷酸序列为SEQIDNo.1。3.根据权利要求1所述的重组表达方法，其特征在于，步骤1所述重组表达载体的构建如下：以合成的含有Brevinin-2GUb基因的质粒为模板，以Bre-FR为引物对通过PCR技术扩增得到Brevinin-2GUb基因，并通过RF克隆将Brevinin-2GUb和pET32系列载体连接，构建出重组表达载体pET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb。4.根据权利要求3所述的重组表达方法，其特征在于，所述Bre-FR的序列如下：Bre-F：5'-ACGACGACGACAAGGCCATGGGTGTTATTATTGATACTCTGAAAG-3'Bre-R：5'-GCTTTGTTAGCAGCCGGATCTCAGCAAGAGTTGGTGCAGTTTGCAGTG-3'。5.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤3所述诱导表达的条件为：12～40℃诱导表达5～25h，诱导剂为IPTG，浓度为0.1～2mM。6.根据权利要求5所述的重组表达方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16±2℃诱导表达20±2h，所述IPTG浓度为1mM。7.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤4所述肠激酶酶切的条件为：在4℃～30℃条件下，肠激酶的用量为1Umg～3Umg融合蛋白，酶切时间为12-36h。8.根据权利要求7所述的重组表达方法，其特征在于，所述肠激酶酶切的条件为：25℃下，2Umg肠激酶酶切融合蛋白24h。9.根据权利要求1～4任意一项所述的重组表达方法，其特征在于，步骤1中所述pET32系列载体为pET32a、pET32b、pET32c载体；步骤2所述大肠杆菌为BL21、BL21DE3、BL21DE3pLysS或BL21DE3Rosetta系列。10.根据权利要求1～9任一项方法制备的Brevinin-2GUb多肽在制备降糖口服液及多肽药物中的应用。

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