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申请/专利权人：海南医学院

摘要：本发明提供一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法，该检测试剂包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μgmL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000，本发明的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，有效实现TDAR实验从定性到定量的转变，可直接进行小鼠TDAR实验的定量分析，并且具有检测灵敏度高，特异性强、操作便利和实用性好的特点。

主权项：1.一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μgmL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000。

全文数据：一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法技术领域本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒及检测方法。背景技术TDAR是B细胞接触T细胞依赖性抗原后产生的抗体反应，在Th2细胞的参与下并产生特异性抗体的一种免疫功能反应。近年来TDAR试验被认为是检测药物潜在免疫毒性预测性较好的功能性试验，通过人为引入外来抗原KLH并检测KLH特异性IgG抗体生成水平，反映待测物对免疫系统整体的影响，预测免疫功能的改变，并能对药物的免疫调节和免疫毒性特点进行早期预测，因此该方法在药物免疫毒理学研究中逐渐得到广泛应用。然而，传统的TDAR试验由于存在抗原特异差、操作复杂及变异性大等问题，导致该试验的特异性、灵敏性、精密性、重复性及可操作性等都存在很大缺陷。KLHkeyholelimpethemocyaninKLH比SRBC具有性质稳定、易标准化和容易获得的优点，更适合作为T细胞依赖性抗原，与SRBC法相比变异性小，结果稳定。KLH做为特异性抗原的TDAR试验方法虽然有诸多优点，但目前也存在一些问题。首先灵敏性问题，不同的免疫剂量、免疫途径及周期可产生不同的免疫效果。其次，TDAR试验检测方法大多采用间接ELISA法，实验结果以定性为主，而对于不同的免疫抑制药物或刺激药物未必都能体现免疫毒性。一些已知免疫抑制剂如化疗药物，本身就存在免疫抑制，需要考察的是免疫抑制程度，可能需要与之相适应的免疫方法，例如定量分析。因此，鉴于这些情况，若能研究出一种可通过定量分析KLH特异性抗体生成量来评价TDAR结果，将极大提高TDAR试验的灵敏性及可实用性，特别是在评价一些肿瘤化疗药的免疫抑制程度显得尤为重要。发明内容鉴于此，本发明提出一种检测灵敏度高，特异性强，并且能够进行定量分析的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒。本发明的技术方案是这样实现的：一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μgmL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000。本发明提出的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，涉及免疫功能定量分析检测技术，包含了免疫蛋白及与之相匹配的检测系统，能够进行有效的T细胞依赖性抗体反应TDAR定量分析，其主要是通过采集被特异性抗原蛋白KLH免疫的Balbc小鼠血清，并结合特定的KLH抗原包被浓度、以及山羊抗小鼠酶标二抗和相应的待检血清的稀释倍率，以满足定量分析的配比条件，使检测系统可通过OD值有效定量分析TDAR实验结果，克服现有实验只能定性分析而不能进行定量分析的缺陷，从而达到了TDAR实验从定性到定量的转变，可直接进行小鼠TDAR实验的定量分析，其具有检测灵敏度高，特异性强、操作便利和实用性好的特点。进一步说明，所述样品稀释液为每100ml含有BSA1g，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。进一步说明，所述洗涤缓冲液为每100ml含有吐温-2050μL，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。进一步说明，所述底物显色液A液为每100mL含有EDTA-2Na0.04g，柠檬酸0.19g，甘油10mL，TMB0.04g，溶媒为去离子水；所述底物显色液B液为每100mL含有醋酸钠2.72g，柠檬酸0.32g，30％H2O260μL，溶媒为去离子水。进一步说明，所述终止液为浓度2molL的硫酸，溶媒为纯水。本发明提供一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：1取出包被抗原蛋白的酶标板，平衡至室温后去除外包装；2将标准品KLH抗体用样品稀释液依次稀释成1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400八个梯度浓度；3将待检样品血清用样品稀释液稀释成1:400～1:800；5加样：加样前向包被抗原蛋白的酶标板中每孔加入200μL5％脱脂奶粉室温再次封闭1h，倒空液体，用洗涤液清板两次，包被抗原蛋白的酶标板设有空白孔、标准品孔、待测样品孔，每个标准品孔、待测样品孔分别加入50μL稀释后的待检样品血清及标准品KLH抗体，空白孔为样品稀释液，每份样品均做复孔，37℃孵育1h或室温孵育3h；6洗板：重复洗板3次后，拍干；7每孔加入50μL稀释倍率为1:16000～1:20000山羊抗小鼠酶标二抗，室温孵育1h；8洗板：重复洗板3次，用洗涤缓冲液浸泡5min，再次洗板5次；9显色及检测：加入显色液100μL孔，其中，底物显色液A液和底物显色液B液各50μL，室温避光孵育10～20min后，加入终止液50μL孔，终止3～5min内，以450nm为检测波长测定OD值，参比波长为630nm。本发明提出的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，不仅通过控制了抗原蛋白KLH的包被浓度和二抗的稀释倍数的两个条件，而进一步制备标准品KLH抗体、KLH免疫条件及待检样品的有效稀释倍率，使整体检测系统更适应于通过OD值更有效分析TDAR实验结果。进一步说明，所述包被抗原蛋白的酶标板的制备，包括如下步骤：1将抗原蛋白KLH按80μgmL浓度溶解于包被液中，包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液；2向96孔酶标板每孔中加入100μL步骤1配制的溶液，于4℃包被过夜后，倒空液体并去除残留液体，用洗涤缓冲液清板两次；3每孔中加入200μL5％脱脂奶粉室温封闭1h，倒空液体4℃真空包装避光保存备用。进一步说明，所述标准品KLH抗体的制备，包括如下步骤：1选用SPF级BALBc小鼠，通过腹腔注射抗原蛋白KLH，免疫剂量为5mgKg，免疫体积0.5mL只，连续免疫4-5次，免疫间隔为7天；2末次免疫后第7天，通过内眦静脉采血，分离血清，采用抗原亲和层析法纯化KLH多克隆抗体，并检测抗体浓度和活性。进一步说明，步骤3中，所述待检样品血清的获取，包括如下步骤：选用成年SPF级BALBc小鼠，分别设有空白对照组、阴性对照组和实验组；实验组注射待测药物，且实验组和阴性对照组分别通过腹腔注射抗原蛋白KLH，空白对照组给予等体积生理盐水，免疫剂量为5～10mgKg，连续免疫2次，免疫间隔为7天；首次免疫后第15天，通过内眦静脉采血，分离血清待检。与现有技术相比，本发明的有益效果是：通过采集被特异性抗原蛋白KLH免疫的Balbc小鼠血清，并结合特定的KLH抗原包被浓度、以及山羊抗小鼠酶标二抗和待检血清的稀释倍率，满足定量分析的配比条件，使检测系统可通过OD值有效定量分析TDAR实验结果，克服现有实验只能定性分析而不能进行定量分析的缺陷，从而达到了TDAR实验从定性到定量的转变，可直接进行小鼠TDAR实验的定量分析，其具有检测灵敏度高，特异性强、操作便利和实用性好的特点。附图说明图1为小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒线性及线性范围检测结果的曲线图；图2为实施例2的各组BALBc小鼠血清KLHIgG抗体检测结果的柱状图。具体实施方式为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1-一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体多克隆IgG、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μgmL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗GoatAnti-MouseIgGHRP的稀释倍率为1:16000～1:20000。所述抗原蛋白KLH钥孔虫戚血蓝蛋白为市售，CAS号：9013-72-3。所述样品稀释液为每100ml含有BSA1g，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。所述洗涤缓冲液为每100ml含有吐温-2050μL，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。所述底物显色液A液为每100mL含有EDTA-2Na0.04g，柠檬酸0.19g，甘油10mL，TMB四甲基联苯胺0.04g，溶媒为去离子水。所述底物显色液B液为每100mL含有醋酸钠2.72g，柠檬酸0.32g，30％H2O260μL，溶媒为去离子水。所述终止液为浓度2molL的硫酸，溶媒为纯水。实施例2-一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，包括如下步骤：1.实验准备A.包被抗原蛋白的酶标板的制备:1将抗原蛋白KLH按80μgmL浓度溶解于包被液中，包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液；2向96孔酶标板每孔中加入100μL步骤1配制的溶液，于4℃包被过夜后，倒空液体并去除残留液体，用洗涤缓冲液清板两次；3每孔中加入200μL5％脱脂奶粉室温封闭1h，倒空液体4℃真空包装避光保存备用。B.标准品KLH抗体的制备:1选用SPF级BALBc小鼠，通过腹腔注射抗原蛋白KLH，免疫剂量为5mgKg，免疫体积0.5mL只，连续免疫4-5次，免疫间隔为7天；2末次免疫后第7天，通过内眦静脉采血，分离血清，采用抗原亲和层析法纯化KLH多克隆抗体，并检测抗体浓度和活性。C.获取待检样品血清：实验组采用环磷酰胺作为待测药物，选用成年SPF级BALBc小鼠，分别设有空白对照组、阴性对照组和实验组；实验组腹腔注射环磷酰胺，且实验组和阴性对照组分别通过腹腔注射抗原蛋白KLH，空白对照组给予等体积生理盐水，免疫剂量为5～10mgKg，连续免疫2次，免疫间隔为7天；首次免疫后第15天，通过内眦静脉采血，分离血清待检。2.小鼠TDAR实验定量分析检测1取出包被抗原蛋白的酶标板，平衡至室温后去除外包装；2将标准品KLH抗体用样品稀释液依次稀释成1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400八个梯度浓度；3将待检样品血清用样品稀释液稀释成1:400～1:800；5加样：加样前向包被抗原蛋白的酶标板中每孔加入200μL5％脱脂奶粉室温再次封闭1h，倒空液体，用洗涤液清板两次，包被抗原蛋白的酶标板设有空白孔、标准品孔、待测样品孔，每个标准品孔、待测样品孔分别加入50μL稀释后的标准品KLH抗体及待检样品血清，空白孔为PBS磷酸盐缓冲液，每份样品均做复孔，37℃孵育1h或室温孵育3h；6洗板：重复洗板3次后，拍干；7每孔加入50μL稀释倍率为1:16000山羊抗小鼠酶标二抗，室温孵育1h；8洗板：重复洗板3次，用洗涤缓冲液浸泡5min，再次洗板5次；9显色及检测：加入显色液100μL孔，其中，底物显色液A液和底物显色液B液各50μL，室温避光孵育10～20min后，加入终止液50μL孔，终止3～5min内，以450nm为检测波长测定OD值，参比波长为630nm。各组BALBc小鼠血清IgG抗体检测结果如下表：表.1各组血清IgG抗体检测结果OD值注：与空白对照组相比，*P＜0.05，与平行对照组相比△P＜0.05各组的血清IgG抗体检测结果OD值实验组与阴性对照组相比，*P＜0.05，与平行对照组相比△P＜0.05，差异具有统计学意义表1及图2。小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒线性及线性范围检测结果如下：如图1所示，用样品稀释液将标准品KLH抗体稀释至不同浓度1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400，其余步骤均与实施例2相同，进行OD值检测。利用对数回归对测定结果拟合，得出方程：y＝0.2643lnx+2.8234，R2＝0.9926，x为稀释倍数，y为OD值，表明本方法的线性良好图1。实施例3-根据实施例2的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，区别在于，在包被抗原蛋白的酶标板的制备过程中，将抗原蛋白KLH按85μgmL浓度溶解于包被液中，其余均实验步骤和参与实施例2相同。实施例4-根据实施例2的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，区别在于，在小鼠TDAR实验定量分析检测的过程，加入50μL稀释倍率为1:20000山羊抗小鼠酶标二抗，其余均实验步骤和参与实施例2相同。实施例5-根据实施例2的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，区别在于，在小鼠TDAR实验定量分析检测的过程，将待检样品血清用样品稀释液稀释成1:800，其余均实验步骤和参与实施例2相同。由实施例3～5中各组血清的IgG抗体检测结果OD值均落入实施例2各组血清的IgG抗体检测结果OD值的范围中。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：包括试剂盒体、抗原蛋白KLH、包被抗原蛋白的酶标板、生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗、标准品KLH抗体、样品稀释液、洗涤缓冲液、底物显色液A液、底物显色液B液和终止液；所述包被抗原蛋白的酶标板中，抗原蛋白KLH的包被浓度为80～85μgmL；所述生物素标记的山羊抗小鼠酶标二抗的稀释倍率为1:16000～1:20000。2.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液为每100ml含有BSA1g，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。3.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述洗涤缓冲液为每100ml含有吐温-2050μL，NaCl0.8g，KCl0.02g，KH2PO40.024g，Na2HPO40.144g，其余为去离子水。4.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液A液为每100mL含有EDTA-2Na0.04g，柠檬酸0.19g，甘油10mL，TMB0.04g，溶媒为去离子水；所述底物显色液B液为每100mL含有醋酸钠2.72g，柠檬酸0.32g，30％H2O260μL，溶媒为去离子水。5.根据权利要求1所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒，其特征在于：所述终止液为浓度2molL的硫酸，溶媒为纯水。6.一种如权利要求1～5中任意一项所述的小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：1取出包被抗原蛋白的酶标板，平衡至室温后去除外包装；2将标准品KLH抗体用样品稀释液依次稀释成1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200和1:6400八个梯度浓度；3将待检样品血清用样品稀释液稀释成1:400～1:800；5加样：加样前向包被抗原蛋白的酶标板中每孔加入200μL5％脱脂奶粉室温再次封闭1h，倒空液体，用洗涤液清板两次，包被抗原蛋白的酶标板设有空白孔、标准品孔、待测样品孔，每个标准品孔、待测样品孔分别加入50μL稀释后的标准品KLH抗体及待检样品血清，空白孔为样品稀释液，每份样品均做复孔，37℃孵育1h或室温孵育3h；6洗板：重复洗板3次后，拍干；7每孔加入50μL稀释倍率为1:16000～1:20000山羊抗小鼠酶标二抗，室温孵育1h；8洗板：重复洗板3次，用洗涤缓冲液浸泡5min，再次洗板5次；9显色及检测：加入显色液100μL孔，其中，底物显色液A液和底物显色液B液各50μL，室温避光孵育10～20min后，加入终止液50μL孔，终止3～5min内，以450nm为检测波长测定OD值，参比波长为630nm。7.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述包被抗原蛋白的酶标板的制备，包括如下步骤：1将抗原蛋白KLH按80～85μgmL浓度溶解于包被液中，包被液为pH9.6碳酸盐缓冲液；2向96孔酶标板每孔中加入100μL步骤1配制的溶液，于4℃包被过夜后，倒空液体并去除残留液体，用洗涤缓冲液清板两次；3每孔中加入200μL5％脱脂奶粉室温封闭1h，倒空液体4℃真空包装避光保存备用。8.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：所述标准品KLH抗体的制备，包括如下步骤：1选用SPF级BALBc小鼠，通过腹腔注射抗原蛋白KLH，免疫剂量为5mgKg，免疫体积0.5mL只，连续免疫4-5次，免疫间隔为7天；2末次免疫后第7天，通过内眦静脉采血，分离血清，采用抗原亲和层析法纯化KLH多克隆抗体，并检测抗体浓度和活性。9.根据权利要求6所述的一种小鼠TDAR实验定量分析检测试剂盒的检测方法，其特征在于：步骤3中，所述待检样品血清的获取，包括如下步骤：选用成年SPF级BALBc小鼠，分别设有空白对照组、阴性对照组和实验组；实验组为待测药物组，且实验组和阴性对照组分别通过腹腔注射抗原蛋白KLH，空白对照组给予等体积生理盐水，免疫剂量为5～10mgKg，连续免疫2次，免疫间隔为7天；首次免疫后第15天，通过内眦静脉采血，分离血清待检。

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