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申请/专利权人：福建农林大学

摘要：本发明公开了烟草CC‑NBS‑LRR类抗病基因NtRRS3及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程领域。本发明首先提供了从烟草抗青枯病品种岩烟97中克隆得到的NtRRS3基因，其核苷酸序列为SEQIDNo.1所示。本发明进一步将上述NtRRS3基因转入到烟草中进行功能验证。结果表明，超表达NtRRS3基因能显著增强感病品种对青枯菌的抗性。本发明分离的NtRRS3基因是调控烟草对青枯菌抗性的重要基因，可提高烟草对青枯病的抗性，在烟草抗青枯病分子育种等方面具有重要应用前景。

主权项：1.烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。

全文数据：NtRRS3基因及其在烟草抗青枯病中的应用技术领域本发明涉及NtRRS3基因及其在烟草抗青枯病中的应用，属于植物基因工程技术领域。背景技术烟草是我国重要的经济作物。烟草青枯病是烟草的重要病害之一，该病害属土传性细菌性病害，从根部或伤口侵入，导致植株枯萎死亡，在中国俗称“烟瘟”。该病分布较为广泛，主要分布于高温高湿的热带及亚热带地区。近年来表现出逐渐向高纬度、高海拔寒带地区扩展的趋势。该病害严重危害我国长江流域及南方的烟叶产区，给烟农造成巨大的损失，造成严重产量损失的有福建、广东、广西等多个省份的烟区。目前尚未有经济有效的防治烟草青枯病手段，而从根本上解决的有效途径是培育抗病品种，与传统育种方法相比，利用基因工程育种手段培育出优质高产的抗青枯病品种可更有效的解决烟草青枯病问题。目前我国已开展了烟草基因组的测序工作，并完成了两个野生原始种的基因组测序，但栽培种的基因组序列尚在组装过程中。这将有利于烟草抗青枯病基因的克隆和鉴定，促进烟草抗青枯病分子育种。细菌性青枯病为害寄主范围很广，但除了拟南芥，尚未从正向遗传学手段获得抗青枯病基因。目前在拟南芥上获得的TIR-NB-LRR类抗青枯基因RRS1-R和LRR-RLK类抗青枯基因ERECTA。而NBS-LRR类抗性基因常包含核苷酸结合位点（NBS）和富亮氨酸重复（LRR）结构域。NBS的保守结构域包含了多个在植物信号转导过程中起关键作用的保守功能区，如P-Loop，Kinase-2，Kinase-3a和GLPL等。LRR结构域则介导病原相关分子模式引发的免疫反应（PTI）中。植物遭到病原菌入侵后，通常会在侵染部位通过产生过敏反应，来抵御病原菌的扩散和繁殖，进而激活下游一系列的相关防卫反应。植物的防御反应过程是复杂的信号转导调控网络作用的结果，该调控网络由抗性通道或SA，ET，JA等植物激素参与的信号转导通路交叉形成。目前烟草中NBS-LRR类抗青枯基因的报道甚少，烟草抗青枯的分子机理及其调控网络的研究甚少，这严重制约了烟草抗青枯病的分子育种进程。本发明针对以上背景技术，研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据分析结果，发现了一个经青枯菌诱导后在抗病品种中上调表达，在感病品种中下调表达的CC-NBS-LRR类抗性基因，命名为NtRRS3，作为抗青枯病关键候选基因。利用Race技术从烟草抗病品种岩烟97中克隆了该基因的全长序列，包含完整的开放阅读框，包含CC基序、NB-ARC和多个富亮氨酸基序（LRR-RI）保守结构域，符合CC-NBS-LRR类的抗病基因家族的特点。利用Gateway技术构建了超表达载体，酶切连接法构建了RNAi载体，分别转入感病品种红花大金元和抗病品种岩烟97中，进行遗传互补功能验证。对转基因烟草植株进行青枯菌接种鉴定，结果发现NtRRS3超表达转基因植株使感病品种表现出略微抗性，而NtRRS3-RNAi干扰转基因植株使感病品种表现出明显的感病。在接种青枯菌后，超表达转基因植株中防御相关基因受诱导上调表达，使其产生抗病防御反应；而在RNAi转基因植株中防御相关基因受诱导后显著下调表达，使其增加对青枯病的感病性。这均说明NtRRS3基因可能参与岩烟97对青枯菌的抗性通道，在抗感品种中可能为非等位基因，其信号调控网络有不同的抗性通路和SA，JA等多条信号转导途径交叉形成，揭示了烟草抗青枯病分子机理的多元性和复杂性。本发明为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。发明内容本发明提供了NtRRS3基因及其在烟草抗青枯病中的应用。其目的在于提供烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3基因的编码序列及其所编码的蛋白，提供含有上述NtRRS3基因的过表达载体以及RNAi干扰载体，并应用于提高烟草对青枯菌的抗性，进而培育抗青枯病烟草新品种（系）。为利用基因工程手段培育抗青枯病烟草新品种提供了基因资源，具有重要的应用前景。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明通过设计引物，从抗青枯病烟草品种岩烟97中克隆NtRRS3基因，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示，其氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。本发明提供了含有所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3基因的过表达载体以及RNAi载体。采用Gateway技术，将NtRRS3基因引入到过表达载体pEarleyGate205中，由增强型启动子35S驱动，载体命名为p35S::NtRRS3-TAP；采用酶切连接法，将NtRRS3基因的正反向插入片段插入到RNAi表达载体pGSA2285中，命名为NtRRS3-RNAi。分别将上述载体转化EHA105农杆菌，通过叶盘法分别将其导入感青枯病品种红花大金元与抗青枯病品种岩烟97中。对转基因后代植株进行青枯菌接种鉴定，结果表明NtRRS3基因的过量表达可显著增强烟草植株对青枯菌的抗性，该基因沉默可降低烟草植株对青枯菌的抗性。有益效果本发明克隆的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3基因可提高烟草对青枯菌的抗性，对于烟草抗青枯病的遗传改良以及培育抗青枯病烟草新品种（系）具有重要的应用价值。附图说明图1RACE获得NtRRS3基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框电泳图。A：5’RACE目的片段；B：3’RACE目的片段；C：cDNA目的片段。M1:DL2,000DNAMarker;M2:DL15,000DNAMarker。图2-1NtRRS3蛋白结构域的多序列比对。图2-2NtRRS3蛋白结构域的多序列比对。图2-3NtRRS3蛋白结构域的多序列比对。图3NtRRS3超表达载体（A）和RNAi载体（B）的构建示意图。图4NtRRS3超表达转基因烟草T0代鉴定。A.DNA水平上的鉴定；B.RNA水平上的鉴定；M：DL2,000DNAMarker。1：阴性对照；2：阳性对照；其余泳道为以T0代植株个体的DNA或sscDNA为模板的扩增产物。图5NtRRS3-RNAi转基因烟草T0代鉴定。A.DNA水平上的鉴定；B.RNA水平上的鉴定；M：DL2,000DNAMarker；1：阴性对照；2：阳性对照；其余泳道为以T0代植株个体的DNA或sscDNA为模板的扩增产物。图6NtRRS3超表达转基因烟草接种青枯菌的表型及其病情指数。图7RNAi干扰沉默NtRRS3转基因烟草接种青枯菌的表型及其病情指数。具体实施方式【实施例1】RACE获得NtRRS3基因3’未知序列和5’未知序列本研究基于实验室前期的烟草基因芯片数据分析结果，发现了一个经青枯菌诱导后在抗病品种中上调表达，在感病品种中下调表达的CC-NBS-LRR类抗性基因，命名为NtRRS3。根据该基因片段，设计引物NtRRS3-3’race-F（5’-AGATTAGGCACTGGAGAGCCAGTTG-3’）和NtRRS3-5’race-R（5’-CTGTGCTGCATGCTAGCTCTATCAC-3’），根据模板接头序列设计一对引物NtLib45-F（5’-GATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTACGCGTGTAAAACGAC-3’）和NtLib39-R（5’-ACCAGGATCTCCTAGGGAAACAGCTATGACCATGTTCAC-3’），用NtRRS3-5’race-R引物和NtLib45-F引物以及NtRRS3-3’race-F引物和NtLib39-R引物配对分别进行5′和3′-RACE反应，5′-RACE反应条件是95℃，5min→（95℃，30s→72℃，2min）5cycles→（95℃，30s→55℃，30s→72℃，30s）30cycles→72℃，10min；3’-RACE反应条件是95℃，5min→（95℃，30s→72℃，2min）5cycles→（95℃，30s→55℃，30s→72℃，30s）30cycles→72℃，10min。PCR扩增产物用浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据生物信息学预测的目的条带大小对产物有目的的回收并连接到载体pMD18-T，然后转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，进行PCR检测，选择阳性克隆送华大基因有限公司测序。将获得的5′和3′未知序列经拼接后获得其全长cDNA序列，根据全长cDNA序列设计扩增ORF框的特异引物NtRRS3-ORF-F（5’-ATGGCTTATGCTGCTATTACTTCCCTCATG-3’）和NtRRS3-ORF-R（5’-CTAATGGATATGGACCTCAATAGAAATTG-3’），以岩烟97叶片cDNA为模板克隆获得目的基因的ORF框序列。反应条件是95℃，5min→（95℃，30s→68℃，2min）5cycles→（95℃，30s→55℃，30s→72℃，30s）30cycles→72℃，10min；PCR扩增产物用浓度为1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，根据生物信息学预测的目的条带大小对产物有目的的回收并连接到载体pDONR207，然后转化感受态大肠杆菌DH5ɑ，挑取单克隆，进行PCR检测，选择阳性克隆送华大基因有限公司测序。NtRRS3基因的3’未知序列和5’未知序列以及ORF框序列的电泳图如图1所示；其完整ORF序列如SEQIDNo.1所示。该基因的cDNA序列全长3016bp，含有编码902个氨基酸残基的ORF框、长度为83bp的5’端非翻译区、长度为224bp的3’端非翻译区、以及26bp的Poly（A）尾巴。利用NCBI上的CDD（ConservedDomainDatabase）软件对NtRRS3蛋白进行保守域预测，该序列包含CC基序、NB-ARC和多个富亮氨酸基序（LRR-RI）保守结构域，符合CC-NBS-LRR类的抗病基因家族的特点。通过BlastP比对烟草NtRRS3编码的蛋白与其他作物的抗性蛋白之间的同源性，结果显示其与马铃薯、番茄、龙葵的同源性分别为61%、60%、56%。运用ClustalW软件，对NtRRS-3与拟南芥、马铃薯、大麦及小麦等四种植物的CC-NBS-LRR类抗性蛋白氨基酸序列比对的结果如图2-1~2-3所示，NtRRS3的CC-NBS-LRR结构域氨基酸序列比较保守，含有P-Loop、Kinase-2a、Kinase-3a和GLPL区域，而保守区域之外的氨基酸序列差异比较大，由此可推断烟草NtRRS3基因属于CC-NBS-LRR类基因家族。【实施例2】NtRRS3超表达载体与RNAi载体构建与验证采用Gateway技术，通过引物对NtRRS3-OE-F（5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTTATGCTGC-3’）和NtRRS3-OE-R（5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGATATGGACCTC-3’）扩增获得不包括终止密码的NtRRS3基因的cDNA编码区片段，经BP反应将该目的片段连接到入门载体pDONR207中，再通过LR反应将该片段从入门载体pDONR207中转移到过表达载体pEarleyGate205中，构建p35S::NtRRS3-TAP过量表达载体（图3A），用于遗传转化烟草红花大金元。采用酶切连接法，通过正向插入的引物对NtRRS3-RNAi-XhoI-F（5’-ATTACTCGAGTCTAATTGATATATGGAGGTGTG-3’）、NtRRS3-RNAi-NcoI-R（5’-ATTACCATGGACAGAGGATTGTTAATGTTAGAG-3’）和反向插入的引物对NtRRS3-RNAi-PacI-F（5’-ACCTTAATTAATCTAATTGATATATGGAGGTGTG-3’）和NtRRS3-RNAi-BamHI-R（5’-ATTAGGATCCACAGAGGATTGTTAATGTTAGAG-3’）分别从岩烟97叶片cDNA模板中扩增得到NtRRS3基因的正反向插入片段，将其插入到酶切后的RNAi表达载体pGSA2285中，构建NtRRS3-RNAi表达载体（图3B），用于遗传转化烟草岩烟97。构建好的载体通过液氮冻融法转化农杆菌EHA105以备烟草转基因用。【实施例3】烟草的遗传转化和转基因烟草的PCR鉴定将分别带有质粒p35S::NtRRS3-TAP过量表达载体和NtRRS3-RNAi干扰载体的农杆菌通过叶盘法转化烟草品种红花大金元和岩烟97中，T0代转基因烟草分别经过Basta和卡那霉素的筛选。分别用100mgmL与75mgL的卡那霉素筛选叶芽及根系生长，在培养过程中用500mgL（Cef）来抑制农杆菌的生长，培养条件温度25℃±2℃，光照每天14h白天10h黑夜。预培养培养基：12MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA，共培养培养基：12MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA+1mgLAS，诱导筛选培养基：MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA+500mgLcef+2.5mgLPPt，MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA+500mgLcef+25mgLKm，筛选培养基：MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA+500mgLcef+4mgLPPt，MS培养基+1.5mgL6-BA+0.1mgLIAA+500mgLcef+50mgLKm，生根培养基：MS培养基+0.5mgLIAA+500mgLcef+4mgLPPt，MS培养基+0.5mgLIAA+500mgLcef+75mgLKm。超表达转基因烟草的PCR检测：根据35S启动子和NtRRS3基因序列设计一对引物引物35S-F（5’-TGATGTGATATCTCCACTGACGTAAG-3’）和NtRRS3-R（5’-GACCCGACTTCGACTCCTCG-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，以35S-F和NtRRS3-R引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer2.0µl，dNTP1.5µl，35S-F0.5µl，NtRRS3-R0.5µl，Taq酶0.1µl，ddH2O14.4µl，模板DNA1.0µl，总体积为20µl。反应程序为：94℃5min→（94℃30s→58℃30s→72℃60s）40cycles→72℃10min→holdat4℃。结果显示，阳性植株PCR扩增获得了一条1650bp的条带（图4A），从84个转基因植株中获得了73株阳性植株。为了解阳性植株转基因是否表达，CTAB法提取了阳性植株的总RNA，经PrimeScript逆转录酶逆转录为单链cDNA，根据NtRRS3基因序列设计引物NtRRS3-F（5’-TGCAGTGTCTGTCTGGATGGAATC-3’）和NtRRS3-R（5’-ACTGGCTCTCCAGTGCCTAATCT-3’），进行RT-PCR分析，所分析的73株阳性植株全部显示表达条带，阳性率为87%（图4B）。RNAi干扰载体转基因植株检测：设计引物NptII-F（5’-AGATGGATTGCACGCAGGTTCTC-3’）和NptII-R（5’-ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-3’），CTAB法提取转基因与非转基因烟草DNA，以转基因植株的DNA为模板，未转化烟草DNA为对照，以NptII-F和NptII-R为引物进行PCR扩增。PCR反应体系为：10×buffer2.0µl，dNTP1.5µl，NptII-F0.5µl，NptII-R0.5µl，Taq酶0.1µl，ddH2O14.4µl，模板DNA1.0µl，总体积为20µl。反应程序为：94℃5min→（94℃30s→55℃30s→72℃30s）40cycles→72℃10min→holdat4℃。结果显示，阳性植株PCR扩增获得了一条500bp的条带（图5A），从79个转基因植株中获得了60个阳性植株；为了解阳性植株转基因是否抑制表达，提取了阳性植物的总RNA，用引物对NtRRS3-RNAi-XhoI-F（5’-ATTACTCGAGTCTAATTGATATATGGAGGTGTG-3’）和NtRRS3-RNAi-NcoI-R（5’-ATTACCATGGACAGAGGATTGTTAATGTTAGAG-3’）进行RT-PCR分析，所分析的60个阳性植株全部显示表达条带（图5B）。通过鉴定获得60株T0代转基因阳性植株，阳性率约79%。【实施例4】转基因植株抗青枯病鉴定对6叶期的野生型烟草植株、过量表达转基因烟草植株和RNAi转基因烟草植株的倒2、倒3功能叶进行接种处理，用一次性1mL注射器沿叶脉注射烟草青枯菌菌液，进行抗性鉴定。每种处理组合设三个生物学重复。通过病情指数具体评价接种植株整体的抗病性。接种20d后转基因植株NtRRS3-OE长势仍然正常，叶片接种部位出现明显的坏死斑，但茎部没有出现传染或仅少数出现轻度的感染，而对照组红花大金元出现死亡的症状，转基因植株NtRRS3-OE的抗性表现明显比野生型红花大金元强（图6A）。63株NtRRS3转基因植株鉴定中，有16株完全没有发病，其他的显示不同程度的发病，其病情指数为37.67（图6B）。接种30d后转基因NtRRS3-RNAi植株叶片接种部位出现明显的坏死斑并传染茎部，出现植株死亡的现象，而对照组岩烟97仅叶片出现坏死斑而未向下传染，长势正常未出现死亡的症状，转基因NtRRS3-RNAi植株的抗性表现明显比对照组岩烟97较感病（图7A）。48株NtRRS3-RNAi转基因植株鉴定中，有2株完全没有发病，其他的都有不同程度的发病，其病情指数为59.72（图7B）。以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。SEQUENCELISTING福建农林大学NtRRS3基因及其在烟草抗青枯病中的应用2222PatentInversion3.313016DNANtRRS3全长cDNA序列1gaaagagattctgccttgtgtatgcacaaactctccatatttttatcacacactacatac60gagagaaagagagaaactgagacatggcttatgctgctattacttcccttatgagcacca120tacaacaatcaatgcaagttactggacttaacctgcaatcgttctatgaaaagcttgaat180ctttgatagctattacggggaaaccatgcaataagataggcaatcttggtgcattgacaa240gattggaagctgaagtgatagagctagcatgcagcacagaagatatggttgactcggaat300caagaaatgttatggttgacctgaaatcaagaaatgttataaacataatttcacgaacag360taacctttgggaaacttcgttccctcttgaaccaagcaatacgagacattgattccacca420cgaagaagtggataggaacacagaccagcctagatctgaaagcacaaaatacgattcttg480cctctacatctgaacgtgctttggagcccgagaatatgatggtcggccatgaaaatgaat540tcgagatgatgcaggtccaactcgctagaggagctagtgaactagaagttgtctcaattg600taggtatggggggcattggcaaaacaactctagctaacaaaatcttcagtgatccactca660ttatgtatcactttgacattcgtgcaaaagttactatttcacaagagtattgtgcgagaa720atggactcctaggccttctgtcttctatcaccggaaagaccgataaaccttatgagcaac780aagatgatgggcaactaaaggaccaacttcaaaagcttctaaaaggtaggagatatttga840tagtcattgatgacatatggaatgaagcagcttgggatgatataaaactatgcttcccag900actgtaacaataggagtcgaatactcttgaccactcgaaatgtgaaagtggctgaatatg960ctagctcaggtaagcctccttatcaaatgcgccttttgaattgcaatgaaagttgggatt1020tactgcacaaaagggtctttctgaatgaatgtttcccccctgaatttgaacaacttggga1080aacaaattgcattaaactgcagaggattacctctagcaattattgtaattgctggacttc1140tctccaaaatcggtaaagcattggatgagtggcaaatggttgttgagaatgtaagttcat1200tagtaagcacagatgttgatgtccaatgcatgagggtgctggcattgagttaccatcact1260tgcctcatcgcctaaaatcgtgctttctgtattttgcaatcttcccagaggatgaacaga1320tttttgtcgataaacttgtggagttatgggcggtagagggatttttcaaggtagaagata1380tgaaaaacatagaaaaggtggggggagaatttctaaaagaacttatagatagaagtttaa1440tttcaatccaaaacttgagttttgatggagaaatcgagagttgtggaatgcatgatttga1500tccgtgaactatgcttgagggaagcccacaacatgaattttgtgaatgttattggagaag1560agaatgatcgaaatccttgtgcgcaattgatgcatttttcgaggagtcgaagtcgggtca1620gtatccaattgaacaatccagacgattctattgaggcaaaattggctatatatcctgaaa1680aagatgcccgttctattatctgttttagagggcattggttcgtgcaaaagtcgttgcgtt1740tcaagctagtaagagtactagatcttgctttagtgagatgtagtacttttccgaggggga1800tacttgatttaattcatttgagataccttgctttgactctttatcctcacttggagtcgg1860gaaaagagattccctcaacaacagtcattcctccactgatatctagcctatgttatctgc1920aaacttttaaactttaccttcctttttccaaagacctggtctttcctttcatattaccat1980cggaaattttggcgataccacaattgaggcacctctttttagattggaattacttgcagt2040cttacaagcctacaaagaaaagtttggttctgaaaaatttgcagtgtctgtctggatgga2100atccttggtattgtactggctctgtctttagactatttcccaacttaaagaagttgcaaa2160tacgtggaatcccaaaagactttattaatcactatgcactctttgatttttgcaacttag2220atcagctcgaggaattggaattttgtgttacttatccacgttttggttgctttctggata2280gaactacacatcaagaaggccgtttgaggcttcatactccccctttatttaatacagaag2340atgcttttgcaccttttcggctacctcatccaaatgattttccacaaaacctaaagaatt2400tagcttttagtggcactttttttcgttggaaggatttgagcatttttggtaaattgccta2460aactcgagtcccttaaacttggatatgatgctttcctagacaaggagtgggaagtatttg2520atgaagtatttcctcgcttgaagttcttgctcctcgaagatttggagattaggcactgga2580gagccagttgcgataattttcctttccttgaacgactatttctcaaaggttgttggtatt2640tggattcaatccctcaaaattttgcagatataaccacacttgctctaattgatataagga2700ggtgtgcaaaatctgttgagaattccgccaagcagattcaacaggacatgcaagataact2760atgcaatttctattgaggtccatatccattaggctaattgtaagaaatggtcttccttga2820tttaattgttgcttgtacaagtactatttgtgtgtccaaatataggagtttatagtccac2880ttaagtttctagtagttggaatataggagccagacaccatttctttgctgctttgcattc2940ttttatgtatcttatgttagcctctaacattaacaatcctctgtaaaaaaaaaaaaaaag3000aaaaaaaaaaaaaaaa30162902PRT氨基酸序列2MetAlaTyrAlaAlaIleThrSerLeuMetSerThrIleGlnGlnSer151015MetGlnValThrGlyLeuAsnLeuGlnSerPheTyrGluLysLeuGlu202530SerLeuIleAlaIleThrGlyLysProCysAsnLysIleGlyAsnLeu354045GlyAlaLeuThrArgLeuGluAlaGluValIleGluLeuAlaCysSer505560ThrGluAspMetValAspSerGluSerArgAsnValMetValAspLeu65707580LysSerArgAsnValIleAsnIleIleSerArgThrValThrPheGly859095LysLeuArgSerLeuLeuAsnGlnAlaIleArgAspIleAspSerThr100105110ThrLysLysTrpIleGlyThrGlnThrSerLeuAspLeuLysAlaGln115120125AsnThrIleLeuAlaSerThrSerGluArgAlaLeuGluProGluAsn130135140MetMetValGlyHisGluAsnGluPheGluMetMetGlnValGlnLeu145150155160AlaArgGlyAlaSerGluLeuGluValValSerIleValGlyMetGly165170175GlyIleGlyLysThrThrLeuAlaAsnLysIlePheSerAspProLeu180185190IleMetTyrHisPheAspIleArgAlaLysValThrIleSerGlnGlu195200205TyrCysAlaArgAsnGlyLeuLeuGlyLeuLeuSerSerIleThrGly210215220LysThrAspLysProTyrGluGlnGlnAspAspGlyGlnLeuLysAsp225230235240GlnLeuGlnLysLeuLeuLysGlyArgArgTyrLeuIleValIleAsp245250255AspIleTrpAsnGluAlaAlaTrpAspAspIleLysLeuCysPhePro260265270AspCysAsnAsnArgSerArgIleLeuLeuThrThrArgAsnValLys275280285ValAlaGluTyrAlaSerSerGlyLysProProTyrGlnMetArgLeu290295300LeuAsnCysAsnGluSerTrpAspLeuLeuHisLysArgValPheLeu305310315320AsnGluCysPheProProGluPheGluGlnLeuGlyLysGlnIleAla325330335LeuAsnCysArgGlyLeuProLeuAlaIleIleValIleAlaGlyLeu340345350LeuSerLysIleGlyLysAlaLeuAspGluTrpGlnMetValValGlu355360365AsnValSerSerLeuValSerThrAspValAspValGlnCysMetArg370375380ValLeuAlaLeuSerTyrHisHisLeuProHisArgLeuLysSerCys385390395400PheLeuTyrPheAlaIlePheProGluAspGluGlnIlePheValAsp405410415LysLeuValGluLeuTrpAlaValGluGlyPhePheLysValGluAsp420425430MetLysAsnIleGluLysValGlyGlyGluPheLeuLysGluLeuIle435440445AspArgSerLeuIleSerIleGlnAsnLeuSerPheAspGlyGluIle450455460GluSerCysGlyMetHisAspLeuIleArgGluLeuCysLeuArgGlu465470475480AlaHisAsnMetAsnPheValAsnValIleGlyGluGluAsnAspArg485490495AsnProCysAlaGlnLeuMetHisPheSerArgSerArgSerArgVal500505510SerIleGlnLeuAsnAsnProAspAspSerIleGluAlaLysLeuAla515520525IleTyrProGluLysAspAlaArgSerIleIleCysPheArgGlyHis530535540TrpPheValGlnLysSerLeuArgPheLysLeuValArgValLeuAsp545550555560LeuAlaLeuValArgCysSerThrPheProArgGlyIleLeuAspLeu565570575IleHisLeuArgTyrLeuAlaLeuThrLeuTyrProHisLeuGluSer580585590GlyLysGluIleProSerThrThrValIleProProLeuIleSerSer595600605LeuCysTyrLeuGlnThrPheLysLeuTyrLeuProPheSerLysAsp610615620LeuValPheProPheIleLeuProSerGluIleLeuAlaIleProGln625630635640LeuArgHisLeuPheLeuAspTrpAsnTyrLeuGlnSerTyrLysPro645650655ThrLysLysSerLeuValLeuLysAsnLeuGlnCysLeuSerGlyTrp660665670AsnProTrpTyrCysThrGlySerValPheArgLeuPheProAsnLeu675680685LysLysLeuGlnIleArgGlyIleProLysAspPheIleAsnHisTyr690695700AlaLeuPheAspPheCysAsnLeuAspGlnLeuGluGluLeuGluPhe705710715720CysValThrTyrProArgPheGlyCysPheLeuAspArgThrThrHis725730735GlnGluGlyArgLeuArgLeuHisThrProProLeuPheAsnThrGlu740745750AspAlaPheAlaProPheArgLeuProHisProAsnAspPheProGln755760765AsnLeuLysAsnLeuAlaPheSerGlyThrPhePheArgTrpLysAsp770775780LeuSerIlePheGlyLysLeuProLysLeuGluSerLeuLysLeuGly785790795800TyrAspAlaPheLeuAspLysGluTrpGluValPheAspGluValPhe805810815ProArgLeuLysPheLeuLeuLeuGluAspLeuGluIleArgHisTrp820825830ArgAlaSerCysAspAsnPheProPheLeuGluArgLeuPheLeuLys835840845GlyCysTrpTyrLeuAspSerIleProGlnAsnPheAlaAspIleThr850855860ThrLeuAlaLeuIleAspIleArgArgCysAlaLysSerValGluAsn865870875880SerAlaLysGlnIleGlnGlnAspMetGlnAspAsnTyrAlaIleSer885890895IleGluValHisIleHis900325DNA人工序列3agattaggcactggagagccagttg25425DNA人工序列4ctgtgctgcatgctagctctatcac25545DNA人工序列5gattctgtggataaccgtattaccgccttacgcgtgtaaaacgac45639DNA人工序列6accaggatctcctagggaaacagctatgaccatgttcac39730DNA人工序列7atggcttatgctgctattacttccctcatg30829DNA人工序列8ctaatggatatggacctcaatagaaattg29948DNA人工序列9ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcaccatggcttatgctgc481048DNA人工序列10ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcctaatggatatggacctc481133DNA人工序列11attactcgagtctaattgatatatggaggtgtg331233DNA人工序列12attaccatggacagaggattgttaatgttagag331334DNA人工序列13accttaattaatctaattgatatatggaggtgtg341433DNA人工序列14attaggatccacagaggattgttaatgttagag331526DNA人工序列15tgatgtgatatctccactgacgtaag261620DNA人工序列16gacccgacttcgactcctcg201724DNA人工序列17tgcagtgtctgtctggatggaatc241823DNA人工序列18actggctctccagtgcctaatct231923DNA人工序列19agatggattgcacgcaggttctc232021DNA人工序列20atcgggagcggcgataccgta212133DNA人工序列21attactcgagtctaattgatatatggaggtgtg332233DNA人工序列22attaccatggacagaggattgttaatgttagag33

权利要求：1.烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3，其特征在于：其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3所编码的蛋白，其特征在于：其所编码的氨基酸序列为SEQIDNO.2所示。3.权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3的超量表达载体，所述超量表达载体的构建方法在于：采用Gateway技术，通过引物对NtRRS3-OE-F：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGGCTTATGCTGC-3’和NtRRS3-OE-R：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTAATGGATATGGACCTC-3’扩增获得不包括终止密码的NtRRS3基因的cDNA编码区片段，经BP反应将该目的片段连接到入门载体pDONR207中，再通过LR反应将该片段从入门载体pDONR207中转移到过表达载体pEarleyGate205中，构建如图3A所示的p35S::NtRRS3-TAP过量表达载体。4.权利要求1所述烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3的RNAi干扰载体，所述RNAi干扰载体的构建方法在于：采用酶切连接法，通过正向插入的引物对NtRRS3-RNAi-XhoI-F：5’-ATTACTCGAGTCTAATTGATATATGGAGGTGTG-3’、NtRRS3-RNAi-NcoI-R：5’-ATTACCATGGACAGAGGATTGTTAATGTTAGAG-3’和反向插入的引物对NtRRS3-RNAi-PacI-F：5’-ACCTTAATTAATCTAATTGATATATGGAGGTGTG-3’和NtRRS3-RNAi-BamHI-R：5’-ATTAGGATCCACAGAGGATTGTTAATGTTAGAG-3’，分别从岩烟97叶片cDNA模板中扩增得到NtRRS3基因的正反向插入片段，将其插入到酶切后的RNAi表达载体pGSA2285中，构建如图3B所示的NtRRS3-RNAi表达载体。5.权利要求1所述的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3或权利要求2所述的蛋白在烟草抗青枯病中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：（1）构建含有权利要求1所述的烟草CC-NBS-LRR类抗病基因NtRRS3的植物表达载体；（2）将所构建的植物表达载体转到烟草中；（3）培育筛选抗青枯病的转基因烟草新品种。

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