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申请/专利权人：江苏大学

摘要：本发明公开了一种提高变色栓菌Trametesversicolor漆酶产量的方法，在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。通过在发酵过程中直接对摇瓶中的菌体进行超声处理，操作简单且减少污染的可能；菌丝生长阶段，采用较高强度的超声使该菌菌丝体出现超支化菌丝形态和球茎状顶部以增加分泌位点的面积，改善细胞膜通透性以加速漆酶的分泌，产酶阶段，采用较低强度超声可以诱导生成活性氧类物质以刺激漆酶基因的表达，从而有效地提高变色栓菌的漆酶产量。实验证明，采用本发明的方法漆酶产量可以提高3倍以上，最大可提高5‑6倍。本发明的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。

主权项：1.一种提高变色栓菌（Trametesversicolor）漆酶产量的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：（1）将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；（2）在发酵的第6～48h对菌体进行超声处理，超声频率为40kHz，功率为150w，时间为工作10s停10s，共10min，超声处理1次；（3）在发酵的第60～120h对菌体进行超声处理，超声频率为28kHz，功率为150w，超声处理3次，每次时间为工作10s停10s、共10min；（4）在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5；（5）超声后继续培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。

全文数据：一种提高变色栓菌Trametesversicolor漆酶产量的方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种提高变色栓菌（Trametesversicolor漆酶产量的方法。背景技术[0002]漆酶laccase，ECl.10.3.2是一种含铜的多酚氧化酶，通过获得氧气催化多种酚类化合物，使之生成对应的苯醌和水。在自然界中，漆酶主要存在于植物、真菌，以及少数的昆虫和细菌中.变色栓菌作为生产漆酶公认的优良菌株之一，是主要的漆酶“生产者”。近年来漆酶因其在工业方面的应用受到越来越多的关注，例如废水处理、生物修复、纸浆的漂白、生物传感器的建立和食品加工等。但是，漆酶发酵表达水平低成为其生产和应用成本高的原因之一。因此，提高漆酶产量，降低其生产成本成为现阶段漆酶研究热点之一。目前，有关提高漆酶产量的研究大都集中于菌株培养基及发酵条件的优化，但此方法工作量大，效率低且漆酶产量的提高是有限的。除此之外，共培养、使用生物表面活性剂及诱导剂等方法也成为提高漆酶产量的常用方法。然而，虽然上述方法对漆酶产量有一定的提高，但对于漆酶的商业化应用而言，其幅度是远远不够的，因此如何大幅度提高漆酶产量依然是研究的重点。[0003]超声是生物细胞培养过程强化的有效手段之一，超声强化可以改善反应体系的传质，超声无论是在多相还是均相反应体系中都可以改善传质和提高反应速率;超声促进生长和次级代谢产物合成，其在生物细胞培养的过程中可以作为一种提高生物量和次生代谢产物产量的一种方式;超声破坏细胞促进胞内产物释放，高强度的超声能够对细胞造成损伤，破坏细胞，使其胞内产物释放;超声反应器在还能作为生物反应器在细胞培养中应用。研究者采用超声强化的手段能够加快水华鱼腥藻Anabaenaflos-aquae的生长速率，且生物量增加46%Franck等人，Effectoflow-doseultrasonictreatmentonphysiologicalvariablesinAnabaenaflos-aquaeandSelenastrumcapricornutum，1990，12:219-224。此外，超声能促进人参Panaxginseng细胞膜的离子通量，提高其次生代谢产物的产量（Wu等人，Elicitor-likeeffectsoflow-energyultrasoundonplantPanaxginsengcells:Inductionofplantdefenseresponseandsecondarymetaboliteproduction,2002,59:51-57。然而，研究者对于超声的生物学效应研究较少，其生物学效应的理论机制不明确。本发明的发明人团队经过前期的大量研究，发现了超声对丝状真菌细胞生长和代谢调节的生理机制；在此基础上，本发明将超声强化引入变色栓菌游离菌丝体的漆酶发酵过程，以期能够通过生长阶段高频超声获得超支化菌丝形态以增加蛋白分泌位点和产酶阶段低频超声提高漆酶基因表达水平的耦合策略，改善丝状真菌变色栓菌的产酶能力，大幅提高变色栓菌的胞外漆酶的表达水平，为降低漆酶生产成本提供一种有效的途径，同时也为其它丝状真菌产胞外蛋白的发酵系统提供一种高效的增产策略。发明内容[0004]本发明提供一种提高变色栓菌产漆酶能力的方法。该方法能够大幅提高变色栓菌的漆酶产量;并且该方法操作简单，易于放大生产。[0005]为实现本发明的目的，本发明提供以下技术方案：[0006]—种提高变色栓菌Trametesversicolor漆酶产量的方法，所述方法包括:在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。优选地，分别在6〜48h的菌丝生长阶段和60〜120h的产酶阶段进行超声处理。[0007]具体包括如下步骤：[0008]1将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；[0009]2在发酵的第6〜48h以频率40〜80kHz，功率30〜210w，总时间2〜20min，工作间隔2〜30s，次数1〜4次对菌丝体进行超声处理；[0010]3在在发酵的第60〜120h以频率10〜30kHz，功率30〜180w，总时间2〜20min，工作间隔5〜30s，次数1〜5次对菌丝体进行超声处理；[0011]⑷超声后继续培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。[0012]优选地所述步骤（1中所述变色栓菌菌丝体预培养方法、发酵培养基的组成采用已有文南犬报道的方法Wang等人，Ultrasound-intensifiedlaccaseproductionfromTrametesversicolor，UltrasonicsSon°Chemistry,2013,20:118-124，培养温度26°C。[0013]进一步地，在发酵的第6〜48h超声处理的频率为40〜80kHz，功率为30〜210w，总时间为2〜20min。优选地，频率可以为OkHz、50kHz、60kHz、70kHz、80kHz，优选为30〜70kHz，更优选为45〜60kHz。优选地，超声处理的功率为3〇¥、6〇¥、9〇¥、12〇¥、15〇¥、18〇¥、21〇¥，优选为60〜180w，更优选为60〜150w。优选地，超声处理的总时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、IOmin、IImin、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，优选为3〜15min，更优选为5〜10min。[0014]进一步地，在发酵的第6〜48h超声处理的工作间隔为5〜30s。优选地，工作间隔为5s、10s、15s、20s、25s、30s，优选为5〜20s，更优选为5〜15s。[0015]进一步地，在发酵的第6〜48h超声处理的次数为1〜4次，每次超声处理间的时间均分。具体可以为1次、2次、3次、4次。[0016]进一步进一步的，在发酵的第60〜120h超声处理的频率10〜30kHz，功率为30〜180w，超声处理的总时间为2〜20min。[0017]优选地，频率为IOkHz、15kHz、20kHz、28kHz、30kHz，优选为15〜30kHz，更优选为20〜30kHz。优选地，超声处理的功率为30w、60w、90w、120w、150w、180w，优选为60〜150w，更优选为60〜120w。优选地，超声处理的总时间为2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、llmin、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min，优选为3〜10min，更优选为4〜6min。[0018]进一步地，在发酵的第60〜120h超声处理的工作间隔为5〜30s。例如5s、10s、15s、2〇8、258、3〇8，优选为5〜2〇8，更优选为5〜158。[0019]进一步地，在发酵的第60〜120h超声处理的次数为1〜5次，每次超声处理间的时间均分。例如1次、2次、3次、4次、5次，优选为2〜4次，更优选为2〜3次，每次超声处理间的时间均分。[0020]本发明提供的提高变色栓菌漆酶产量的方法，是在发酵过程中直接对摇瓶中的菌体进行超声处理，操作简单且减少污染的可能;菌丝生长阶段，采用较高强度的超声使该菌菌丝体出现超支化菌丝形态和球茎状顶部以增加分泌位点的面积，改善细胞膜通透性以加速漆酶的分泌，产酶阶段，采用较低强度超声可以诱导生成活性氧类物质以刺激漆酶基因的表达，从而有效地提高变色栓菌的漆酶产量。实验证明，采用本发明的方法漆酶产量可以提高3倍以上，最大可提高5-6倍。本发明的方法操作简单，易于放大生产，适于大规模漆酶发酵，从而降低漆酶生产成本，满足规模化应用的要求。具体实施方式[0021]以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。[0022]实施例[0023]变色栓菌的活化和预培养[0024]⑴、活化[0025]变色栓菌Trametesversicolor购买自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC14001。[0026]采用常用土豆培养基配制方法配制斜面活化用的培养基，其中土豆200gL、葡萄糖20gL、琼脂粉15gL;将变色栓菌CICC14001接种到该培养基上，28°C培养5〜7天。[0027]⑵、预培养[0028]采用常用土豆培养基配制方法配制预培养用的培养基，其中土豆200gL、葡萄糖2〇gL;将活化后的菌丝体接种于该培养基中，于30°C、150rmin条件下培养7天;将培养物均质后按10%vv接种量接入新鲜培养基，培养5天，即得预培养的菌丝体，用于漆酶发酵。[0029]下面描述变色栓菌漆酶发酵的具体实施例。其中所用的漆酶发酵培养基的成分及含量如下：KH2PO40.2gL，CaCl2·2H200.0755gL，MgS〇4·7H200.05gL，NH4H2P〇40.5gL，FeS〇4·7H200.035gL，葡萄糖2gL，NH4Cl0.267gL，CuS〇4·5H200.1gL。[0030]实施例中出现的“第Xh”或“Xh后”均是指从步骤⑴中接种并开始发酵培养的时刻算起。[0031]实施例1:变色栓菌漆酶发酵[0032]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0033]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为45kHz，超声功率为120w，超声时间为工作IOs停10s，共5min，次数2次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为20kHz，功率为150w，次数3次，其余条件不变，超声后继续培养。[0034]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0035]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。培养效果测试：[0036]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了313%见表1。[0037]实施例2:变色栓菌漆酶发酵[0038]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0039]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为50kHz，功率为90w，时间为工作IOs停10s，共lOmin，超声次数1次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为28kHz，功率为120w，超声次数2次其余条件不变，超声后继续培养。[0040]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0041]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0042]培养效果测试：[0043]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了355%见表1。[0044]实施例3:变色栓菌漆酶发酵[0045]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0046]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为60kHz，功率为60w，时间为工作20s停20s，共20min，超声次数1次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为28kHz，功率为120w，超声次数2次其余条件不变，超声后继续培养。[0047]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0048]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0049]培养效果测试：[0050]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了459%见表1。[0051]实施例4:变色栓菌漆酶发酵[0052]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0053]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为80kHz，功率为30w，时间为工作IOs停10s，共5min，超声次数2次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为28kHz，功率为150w，超声次数3次其余条件不变，超声后继续培养。[0054]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0055]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0056]培养效果测试：[0057]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了483%见表1。[0058]实施例5:变色栓菌漆酶发酵[0059]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0060]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为70kHz，功率为60w，时间为工作IOs停10s，共lOmin，超声次数1次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为20kHz，功率为60w，超声次数3次其余条件不变，超声后继续培养。[0061]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0062]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0063]培养效果测试：[0064]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了457%见表1。[0065]实施例6:变色栓菌漆酶发酵[0066]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0067]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为40kHz，功率为150w，时间为工作IOs停10s，共lOmin，超声次数1次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为28kHz组合，功率为150w超声次数3次，其余条件不变，超声后继续培养。[0068]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0069]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0070]培养效果测试：[0071]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了603%见表1。[0072]实施例7:变色栓菌漆酶发酵[0073]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0074]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为50kHz，功率为60w，时间为工作IOs停10s，共lOmin，超声次数1次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为28kHz，功率为150w超声次数3次，其余条件不变，超声后继续培养。[0075]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0076]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0077]培养效果测试：[0078]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提高了453%见表1。[0079]实施例8:变色栓菌漆酶发酵[0080]1在温度26°C、150rmin条件下，将预培养的变色栓菌菌丝体以10%vv的初始生物量接种到漆酶发酵培养基中，在此条件下进行发酵培养；[0081]2在发酵过程的第6〜48h对三角瓶中的菌体进行超声处理，频率为40kHz，功率为120w，时间为工作IOs停10s，共lOmin，超声次数2次;在发酵过程的60〜120h对菌体进行超声处理，频率为60kHz组合，功率为150w超声次数3次，其余条件不变，超声后继续培养。[0082]3在发酵过程的第1天至第3天，调节pH至4.5。[0083]⑷在发酵培养7天后，收集发酵液，除去菌丝体后测定漆酶产量。[0084]培养效果测试：[0085]在此法超声处理条件下培养的变色栓菌漆酶产量比不超声条件下的漆酶产量提尚了393%见表1。[0086]漆酶酶活的测定[0087]以邻苯二酚为底物，3mL0.1%wv邻苯二酚溶液（以0.lmolLpH3.0酒石酸缓冲液配制加入适量漆酶，25°C反应5min，450nm处测定吸光度值变化[250]，摩尔消光系数ε=2211Lmol·cm。酶活的定义：1分钟氧化1微摩尔邻苯二酸所需漆酶的量定义为一个酶活单位⑹。[0088]发酵液漆酶活力的检测取离心获得的发酵液清液进行活力测定。测定结果如表1所示。[0089]表1漆酶酶活的测定[0091]注:*为相应实施例中，其它条件完全相同，只是未超声的对照。[0092]申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不能以此来限定本发明的权利范围。因此，对本发明的任何改进，对本发明所涉及菌种、产品及各原料的等效替换及具体操作选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

权利要求：1.一种提高变色栓菌Trametesversicolor漆酶产量的方法，其特征在于，所述方法包括:在变色栓菌漆酶发酵过程中对菌体进行超声处理并继续发酵以产生漆酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分别在发酵的第6〜48h和发酵的第60〜120h进行超声处理。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵的第6〜48h超声处理的频率为40〜80kHz，功率为30〜210w，总时间为2〜20min。4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，在发酵的第6〜48h超声处理的工作间隔为5〜30s。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在发酵的第6〜48h超声处理的次数为1〜4次，每次超声处理间的时间均分。6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在发酵的第60〜120h超声处理的频率10〜30kHz，功率为30〜180w，超声处理的总时间为2〜20min。7.根据权利要求2或6所述的方法，其特征在于，在发酵的第60〜120h超声处理的工作间隔为5〜30s。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在发酵的第60〜120h超声处理的次数为1〜5次，每次超声处理间的时间均分。9.根据权利要1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：1将预培养的变色栓菌菌丝体接种到漆酶发酵培养基中，进行发酵培养；2在发酵的第6〜48h以频率40〜80kHz，功率30〜210w，总时间2〜20min，工作间隔2〜30s，次数1〜4次对菌丝体进行超声处理；⑶在发酵的第60〜120h以频率10〜30kHz，功率30〜180w，总时间2〜20min，工作间隔5〜30s，次数1〜5次对菌丝体进行超声处理；⑷超声后继续培养至发酵液中漆酶活力达到峰值时，结束发酵并收集发酵液。

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