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申请/专利权人：中南大学湘雅二医院

摘要：本发明提供一种AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为滤泡性T辅助细胞Tfh中的应用。直接将AIM2蛋白或AIM2过表达质粒转入CD4+T细胞，尤其是研究表达人AIM2基因序列的过表达质粒对Tfh细胞分化及功能的影响。将该质粒转染到人CD4+T细胞，并同时诱导分化成为Tfh细胞,通过与转染空质粒后的诱导分化形成的Tfh细胞比较，反映出其对Tfh诱导分化及功能的影响。为进一步研究AIM2及Tfh细胞生理功能及临床意义提供依据。

主权项：1.AIM2蛋白在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用，具体是将表达AIM2的质粒转入CD4+T细胞，用于研究AIM2蛋白在诱导分化T细胞转化为Tfh细胞过程中的作用机理，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括：STAT3、C-MAF、BCL-6，所述的应用为体外应用。

全文数据：AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用技术领域本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用。背景技术Tfh细胞作为新近发现的CD4+T辅助细胞亚群，由于其对B细胞成熟和免疫球蛋白Ig的分泌有重要辅助作用以及其在SLE系统性红斑狼疮中的表达比例异常，让人们确信其在病理性自身抗体的分泌中具有重要意义。Tfh细胞通过促进生发中心GC的形成、抗体亲和力的成熟、以及记忆型B细胞和胞浆细胞的生成，来辅助B细胞。在人体研究中发现SLE病人外周血中循环CXCR5hiPD-1hiICOShiT细胞cTfh细胞的比例升高，并且与疾病严重程度成正相关，而在经过类固醇治疗后Tfh细胞的比例下降。正常状态下，人体外周血及淋巴器官中的Tfh细胞比例较低，且分离困难，因此建立体外有效的Tfh细胞分化培养就显得尤为关键。AIM2是炎症小体HIN200家族蛋白中的一员。在之前研究报道中，AIM2是一种炎症小体的组成部分，在免疫细胞中例如巨噬细胞和树突状细胞发现，AIM2的C末端的A200是细胞内DNA感受器，感受细菌或病毒感染时释放到细胞胞浆中的dsDNA,而AIM2的N末端的PYD结构域与ASC结合形成AIM2-炎症小体。该炎症小体能参与caspase-1的活化过程，进而在免疫活动中促进细胞因子前体pro-IL-1β和pro-IL-18的切割成熟，同时它还能参与caspase-1依赖的细胞程序式凋亡，因此认为AIM2有免疫感应和炎性体激活功能。研究发现AIM2在不同的细胞类型中其表达和功能不同。在肿瘤细胞中发现，AIM2的作用并不依赖于炎症小体，其行使类似于抑癌基因的作用。在肿瘤细胞中将其敲除，将促进肿瘤的发生发展。而在CD4+T细胞，特别是滤泡性辅助T细胞Tfh细胞中，我们首次发现其表达尤其明显。发明内容本发明的首要目的是提供AIM2蛋白在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用。用于研究AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞过程中的作用机理。进而研究AIM2对Tfh细胞分化及功能的影响。本发明的研究对象AIM2蛋白和CD4+T细胞均来源于人，但不仅限于人。上述应用可以直接将AIM2蛋白加入CD4+T细胞用于将其转化为Tfh细胞，或者将表达AIM2的质粒转入CD4+T细胞用于将其转化为Tfh细胞。本发明的第二个目的是提供AIM2蛋白在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用。本发明的第三个目的是提供表达AIM2的质粒在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用。AIM2的DNA序列见序列表SEQNO.1所示。本发明所述的表达AIM2的质粒是将AIM2的mRNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模版扩增AIM2基因片段；基因片段插入到载体获得。本发明以pcDNA3.1+购于金斯瑞生物科技公司为例，酶切位点为NheIHindIII，成功将制备的载体转入T细胞，将其应用于诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞。但本发明不限于使用载体pcDNA3.1+，还包括其他能够在CD4+T细胞中表达AIM2基因的载体。具体过程如下：取正常人外周血，密度梯度离心法无菌分离PBMC，采用Miltenyi公司的MACSCD4+Tkit进行磁珠分选，获得CD4+T细胞。提取总mRNA并逆转录为cDNA作为PCR扩增模板，设计引物扩增人AIM2基因，分别在上游引入NheI内切酶位点，下游引入HindIII内切酶位点。对载体质粒pcDNA3.1+及目的片段同样用NheIHindIII双酶切进行处理，经T4DNA连接酶构建重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌，挑取单个克隆菌落，进行PCR及双酶切验证。构建成功的重组表达载体pcDNA-AIM2经过电转转染进CD4+T细胞，后进行Tfh细胞诱导分化，后通过流式、RT-PCR测定Tfh分化的差异。本发明过表达载体的转入，进一步明确AIM2在Tfh细胞诱导分化中的作用，为AIM2及Tfh细胞分化及功能研究提供新思路。附图说明图1为流式细胞技术检测AIM2商品化蛋白刺激后，对Tfh分化比例的影响；A：流式结果显示，AIM20.1ugml能刺激Tfh细胞的诱导分化；B：统计学分析结果显示，AIM2刺激能明显增加Tfh细胞分化比例n＝4，以4个样本为检测对象，p0.05；Ctrl为空白对照；CD4、CXCR5、PD-1均为Tfh细胞的表面标记物；CXCR5gatingonCD4即在CD4+T细胞上看CXCR5的表达。图2为流式细胞技术检测AIM2质粒转染后对Tfh分化比例的影响；与空质粒PCDNA相比，AIM2质粒转染后能明显增加Tfh的比例以3个样本为检测对象。图3为QPCR检测AIM2质粒转染后对Tfh分化相关转录因子的影响；相比较转染空质粒组PCDNA，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括：AIM2、STAT3、C-MAF、BCL-6。具体实施方式以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法，如无特别说明，均采用本领域常规技术，实验试剂均为市售产品。1载体pcDNA3.1+-AIM2的构建1.1总RNA提取收集CD4+T细胞离心后弃上清，用PBS将细胞洗涤两遍，每管细胞中加入Trizol试剂1ml，充分吹打混匀，室温下静置5min，吹打，使细胞完全裂解，移至新的1.5mlEP管中；加入200μl4℃预冷的氯仿，剧烈震荡混匀；4℃，12000rpm，离心15min；将上层水相移至另一新的1.5mLEP管内；加入等量的4℃预冷的异丙醇，上下轻柔颠倒混匀，-20℃放置3-4h；4℃，12000rpm，离心30min；弃上清，加入4℃预冷的75％无酶乙醇1ml，轻柔上下颠倒洗涤RNA沉淀，4℃，7500rpm，离心5min，重复洗涤一次；弃上清，用移液枪将液体吸干，室温干燥RNA约5min，加入20μl无酶水，充分溶解RNA沉淀，测量浓度和OD值，置于-80℃冰箱保存。1.2cDNA的制备冰上溶解RNA样本。进行基因组DNA去除反应Takara公司，取无酶200μlPCR反应管，置于冰上，按下表依次加入：轻弹管壁充分混匀，简短离心，42℃孵育2min，4℃孵育5min。将反应管置于冰上，按照下表进行逆转录Takara公司反应液配置：混匀，简短离心后放入PCR仪上；37℃孵育15min，85℃孵育5s，保持在4℃进行PCR的条件；收集cDNA保存于-20℃。1.3PCR扩增目的基因扩增人AIM2基因的引物序列为铂尚生物科技公司合成：上游：ATGTGAAGCCGTCCAGA见序列表SEQNO.3；下游：CATCATTTCTGATGGCTGCA见序列表SEQNO.4。上游引入NheI内切酶位点，下游引入HindIII内切酶位点。以cDNA为模板，按照下表配置PCR反应体系：PCR反应条件为：1.4对载体质粒pcDNA3.1+及扩增出来的目的片段同样用NheIHindIII双酶切进行处理，经T4DNA连接酶构建重组质粒。将重组质粒转化入大肠杆菌，挑取单个克隆菌落，进行PCR及双酶切验证。本发明中重组表达载体的测序验证序列为Pyrin区域，见序列表SEQNO.2所示，其可与ASC结合形成炎症小体。2密度梯度离心法获得PBMC获志愿者知情同意后，抽取正常人静脉血，约60ml，分装在3支50ml无菌离心管中，每管20ml，加入20Uml肝素，颠倒混匀，每管血中加入15ml常温PBS，充分混匀；取50ml的无菌离心管，每管加入15ml无菌淋巴细胞分离液，用移液管沿管壁缓慢将外周血加于淋巴细胞分离液上；2000rpm加速减速均为0，18℃，离心30min，吸取白色云雾层，置入另一离心管中；吸取30mlPBS至离心管中，充分混匀，4℃，2000rpm离心15min；同上用PBS洗细胞两次，得到PBMC外周血单个核细胞，进行细胞计数。3外周血CD4+T细胞的分离纯化使用Miltenyi公司的MACSCD4+T磁珠从PBMCs中分离CD4+T细胞，每107个细胞加入试剂如下：40μl预冷的buffer，重悬细胞；10μlCD4+TcellBiotin-AntibodyCocktailII，充分吹打混匀，避免产生气泡；放置4℃避光孵育15min；4℃2000rpm离心10分钟后用500ulbuffer重悬。将LS分离柱放置在分选器上，将3ml预冷的buffer加入LS分离柱中，使分离磁珠润湿，润柱液丢弃；用移液枪将重悬的细胞悬液加入分离柱；等分离柱中液体滴完后，再用预冷的3mlbuffer洗涤装了细胞的离心管和分离柱，每次3ml共3次；收集流出的液体，1000rpm，4℃，离心10min，细胞计数。4转染AIM2过表达质粒：以转染空质粒pcDNA3.1+为对照，通过电转染，将AIM2过表达质粒转染入分离出的CD4+T细胞中，转染4-6小时后换液。5诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化取24孔培养板，提前加入0.5ml含10μgmlAnti-CD3抗体的PBS溶液，将24孔板放入细胞培养箱37℃孵育4-6h；用含10％FBS和青链霉素双抗的RPMI-1640细胞培养基，重悬CD4+T细胞；取出包被Anti-human-CD3抗体后的24孔板，用移液器弃去孔板中的PBS；取5×105个mlCD4+T细胞的培养液1ml加入孔板的每个孔中；向24孔板中分别加入相应抗体和细胞因子，诱导CD4+T细胞向Tfh细胞分化，通过与空质粒组进行比较，其余变量一律每组相同。各成分及终浓度为：诱导分化5天后收集细胞进行后续实验。6流式细胞术进一步检测诱导分化后，Tfh细胞相关表面标记物的表达量，进一步判断Tfh细胞的表达情况。将诱导分化5天后的CD4+T细胞收集到流式管中，每1X106个细胞加入1ulAPC-CD4，1ulAPC-cy7-CXCR5，1ulPE-PD-1抗体，4℃避光孵育30分钟。使用BDFOXP3破核膜液破核膜后，上CANONII流式机，结果见附图2。7QPCR检测AIM2质粒转染后对Tfh分化相关转录因子的影响。相比较转染空质粒组PCDNA，转染AIM2过表达质粒后Tfh细胞重要转录因子表达量增加；这些因子包括：AIM2、STAT3、C-MAF、BCL-6。结果见附图3。序列表110中南大学湘雅二医院120AIM2在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用1604170SIPOSequenceListing1.021012111071212DNA213智人Homosapiens4001atggagagtaaatacaaggagatactcttgctaacaggcctggataacatcactgatgag60gaactggataggtttaagttctttctttcagacgagtttaatattgccacaggcaaacta120catactgcaaacagaatacaagtagctaccttgatgattcaaaatgctggggcggtgtct180gcagtgatgaagaccattcgtatttttcagaagttgaattatatgcttttggcaaaacgt240cttcaggaggagaaggagaaagttgataagcaatacaaatcggtaacaaaaccaaagcca300ctaagtcaagctgaaatgagtcctgctgcatctgcagccatcagaaatgatgtcgcaaag360caacgtgctgcaccaaaagtctctcctcatgttaagcctgaacagaaacagatggtggcc420cagcaggaatctatcagagaagggtttcagaagcgctgtttgccagttatggtactgaaa480gcaaagaagcccttcacgtttgagacccaagaaggcaagcaggagatgtttcatgctaca540gtggctacagaaaaggaattcttctttgtaaaagtttttaatacactgctgaaagataaa600ttcattccaaagagaataattataatagcaagatattatcggcacagtggtttcttagag660gtaaatagcgcctcacgtgtgttagatgctgaatctgaccaaaaggttaatgtcccgctg720aacattatcagaaaagctggtgaaaccccgaagatcaacacgcttcaaactcagcccctt780ggaacaattgtgaatggtttgtttgtagtccagaaggtaacagaaaagaagaaaaacata840ttatttgacctaagtgacaacactgggaaaatggaagtactgggggttagaaacgaggac900acaatgaaatgtaaggaaggagataaggttcgacttacattcttcacactgtcaaaaaat960ggagaaaaactacagctgacatctggagttcatagcaccataaaggttattaaggccaaa1020aaaaaaaaacatagagaagtaaaaaggaccaattcaagccaactggtctaa107121022111005212DNA213智人Homosapiens4002ctgtacatggagaagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttcca60ctggtgacgcggcccagccggccaggcgcgccgtacgaagcttggtaccgagctcggatc120ccctggtccacaaatcaagctcccaaggtcaagatcgccacatgattagaatgcgtcaac180ttatagatattgttgatcagctgaaaaattatgtgaatgacttggtccctgaatttctgc240cagctccagaagatgtagagacaaactgtgagtggtcagctttttcctgctttcagaagg300cccaactaaagtcagcaaatacaggaaacaatgaaaggataatcaatgtatcaattaaaa360agctgaagaggaaaccaccttccacaaatgcagggagaagacagaaacacagactaacat420gcccttcatgtgattcttatgagaaaaaaccacccaaagaattcctagaaagattcaaat480cacttctccaaaagatgattcatcagcatctgtcctctagaacacacggaagtgaagatt540cccctcgaggagggcccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgaatagcgccgtcg600accatcatcatcatcatcattgagtttaaacccgctgatcagcctcgactgtgccttcta660gttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgcca720ctcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtc780attctattctggggggtgggggtggggcaggacagcaagggggaggaatgggaagacaat840agcaggcatgctggggatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaaagaaccagctgg900ggctctagggggtatccccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggggggggtggtg960gttacgcgcagcgtgaccgctaccttggcagggcctaagggcggt1005210321117212DNA213未知Unknown4003atgtgaagccgtccaga17210421120212DNA213未知Unknown4004catcatttctgatggctgca20

权利要求：1.AIM2蛋白在诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，用于研究AIM2蛋白在诱导分化T细胞转化为Tfh细胞过程中的作用机理。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，AIM2蛋白和CD4+T细胞均来源于人。4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，直接将AIM2蛋白或表达AIM2的质粒转入CD4+T细胞。5.AIM2蛋白在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，AIM2蛋白和CD4+T细胞均来源于人。7.表达AIM2的质粒在制备诱导分化CD4+T细胞转化为Tfh细胞制剂中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，AIM2蛋白和CD4+T细胞均来源于人。9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，所述的表达AIM2的质粒是将AIM2的mRNA逆转录为cDNA，并以cDNA为模版扩增AIM2基因片段；基因片段插入到载体获得。

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