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申请/专利权人：中国工程物理研究院核物理与化学研究所

摘要：本发明公开了一种均环肽Cyclo‑Cys6的制备方法，包括：1树脂与带保护基的半胱氨酸进行反应连接，形成连接有一个半胱氨酸的树脂；2树脂连接的一个半胱氨酸与带保护基的半胱氨基酸连续缩合，形成连接有直链肽的树脂；3直链肽从树脂上切割下来，首尾相连环化，得到环肽粗品；4环肽的纯化与保存。本发明所制备的Cyclo‑Cys6为由单一氨基酸所形成的均环肽结构，具有与冠醚类化合物极其类似的结构，分子在结构上具有很好的规整性及多向对称性，更易于自组装成为离子通道或者纳米管，从而作为药物载体、膜通道、分子器件等；侧链上含有多个巯基官能团，使得其具有更好的反应活性，可作为高效点击反应的前体试剂；同时，工艺合理、操作简捷，且合成效率较高。

主权项：1.一种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸、N,N-二异丙基乙胺DIEA加入树脂中，再加入二甲基甲酰胺DMF使之溶解，室温下震荡反应30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基；取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰；步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段；用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应；采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20℃保存；所述步骤三中，完成环化反应后，将物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为50～100Gy.min-1，辐照剂量为10～20kGy，搅拌速度为100～150r.min-1；所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷DCM浸泡，并震荡30min；其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基；所述步骤一和步骤二中，取样检测的方法为：取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5％的茚三酮乙醇溶液、0.3％的抗坏血酸溶液、60％的苯酚溶液各一滴，同时加热至105～110℃并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基；所述步骤二中，半胱氨酸之间的缩合，采用的试剂及反应条件为：加入缩合试剂三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量或N,N-二异丙基碳二亚胺三倍摩尔过量，反应30min，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂；所述缩合试剂为苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羟基苯并三氮唑、2-7-偶氮苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯中的任意一种；所述步骤三中，将直链肽从树脂上切割下来时所选用切割液为：三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为1～2％，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1～2h；所述步骤三中，直链肽环化反应的条件为：加入环化试剂苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min；其中，均环肽Cyclo-Cys6的结构式为：

全文数据：均环肽CycIo-Cys6的制备方法技术领域[0001]本发明属于多肽合成技术领域，涉及环肽类化合物的固相化学制备方法，尤其涉及环肽化合物环肽Cyclo-Cys6及其合成制备工艺。背景技术[0002]环肽在结构组成上与普通链状肽类具有结构的高度相似性，但因其主体结构中氨基酸残基参与连接成环，以致分子中的游离羧基、氨基等亲水基团消失或减少，使得其极性降低、脂溶性增强、对体内氨羧肽酶的敏感性降低、在生物体内的稳定性增加；同时，肽链运动的自由度减少，在溶液中具有相对稳定的明确构象，与受体契合的可能性明显提高。[0003]现有技术中，合成环肽首先是合成链状肽前体。链状肽的合成方法目前主要有固相法和液相法两种合成方式，由于固相法独特的优势，己成为实验室多肽合成的首选方法，直链肽的合成己趋自动化和商业化，但环肽的合成还存在着一定的难度，其关键问题在于链状肽的合环步骤。通常环状肽的合环方式分为首尾相连、侧链之间相连、侧链与端基相连，或借助于二硫键、醋键遊鹏程,潘俊峰，马亚平，袁建成.一种环醋肽OrafamideA的固相合成方法.CN103626848B[P].2013-11-29等相连;其中，链状肽首尾相连成环的合成难度更大，但也更具有研宄意义。通常情况下，合成首尾相连型环肽的经典方法是在稀溶液1T3〜lO'ol.I1中，用活泼酯法或叠氮法将带有保护基的的线性前体肽选择性地活化并合环;使用二环己基碳二亚胺DCC、4_二甲氨基吡啶DMAP等有机缩合剂，产率通常低于30%，且反应时间很长。[0004]近年来，2_7_偶氮苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯HATU、苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯HBTU、1-羟基苯并三氮唑HOBt、0-苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲四氟硼酸TBTU等苯并唑类有机缩合剂的使用，为环肽合成方法的研究提供了很大帮助;但迄今为止，主要应用于RGD环肽含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的环肽）的合成王锡平.RGD合成制备工艺.CN，103588863B[P].2013-11-15.，尚未见有关新型均环肽Cyclo-Cys6,尤其是其化学制备方法相关工艺的报道。发明内容[0005]本发明的一个目的是解决至少上述问题和或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。[0006]为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0007]步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸、N，N-二异丙基乙胺加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应30〜60min;然后加入甲醇孵育2〇min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上;去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取样检测确保氨基酸已经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；[0008]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰；[0009]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入裂解液，脱除巯基上的三苯甲基保护基;用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；[0010]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存。[0011]优选的是，所述树脂为2-氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷浸泡，并震荡30min;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基；[0012]所述步骤一和步骤二中，取样检测的方法为:取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇_3%的抗坏血酸溶液、60%的苯酚溶液各一滴，同时加热至105〜110°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并己裸露出不带保护的氨基。[0013]优选的是，所述步骤一和步骤二中，每次所加入的氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸的用量均三倍摩尔过量于树脂;所述步骤一和步骤二中，去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂。[0014]优选的是，所述步骤二中，半胱氨酸之间的缩合，采用的试剂及反应条件为：加入缩合试剂苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯或1-羟基苯并三氮唑三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量或N，N-二异丙基碳二亚胺三倍摩尔过量，反应30min，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂。[0015]优选的是，所述步骤三中，将直链肽从树脂上切割下来时所选用切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为1〜2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;所述步骤三中，直链肽环化的反应条件为:加入环化试剂苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应3〇min。[0016]优选的是，所述步骤三中，裂解液为为体积比为M•5:1:2•5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和纯水组成的混合液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h。[0017]优选的是，所述步骤四中环肽的纯化阶段，HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为〇.1%三氟乙酸的水溶液A和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5tnin，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30.10min停止。[0018]优选的是，所述步骤一中，在震荡反应之前将带保护基的半胱氨酸、N，N-二异丙基乙胺、树脂和DMF加入超临界反应装置中，在体系密封后通入二氧化碳至25〜40MPa，搅拌反应30〜45min，搅拌速度为100〜150r.min_1。[0019]优选的是，所述步骤三中，完成环化反应后，将产物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为50〜100Gy.min-i，福照剂量为10〜20KGy，搅拌速度为l〇〇〜150r•min1。[0020]优选的是，所述步骤四中，冻干的过程为:将纯化后的环肽置于真空冷冻干燥机内进行预冷冻，设定预冷冻温度为-10〜-20-C，干燥机内温度下降的速度为0.5〜1。：.min1，到达设定温度后保温10〜30min;然后开启千燥机的抽真空装置进行抽真空处理，使干燥机内的气压介于20〜50Pa，且将干燥机的干燥温度设定在—6〇〜-80°C，保温1〜3h;保持干燥机的真空压力，开启干燥机的加热装置，使干燥温度以丨〜2。：•min_1的速度上升到25〜30°C，保温1〜此;停止干燥机的抽真空处理，向干燥机内缓慢充入氮气，直至干燥机内的气压介于0.10〜O.llMPa之间并保压1〇〜2〇min，再释放至常压完成干燥过程。[0021]本发明至少包括以下有益效果:本发明所制备的Cyclo-Cys6为由单一氨基酸所形成的均环肽结构，具有与冠醚类化合物极其类似的结构，与杂环肽相比，分子在结构上具有很好的规整性及多向对称性，更易于自组装成为离子通道或者纳米管，从而作为药物载体、膜通道、分子器件等;环肽侧链上含有多个巯基官能团，使得其具有更好的反应活性，可作为高效点击反应的前体试剂;同时，工艺合理、操作简捷，且合成效率较高。[0022]本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明：[0023]图1为本发明制备的均环肤Cyclo-Cys6的分子结构式；[0024]图2为本发明制备方法的工艺流程图。具体实施方式：[0025]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。[0026]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。[0027]实施例1:[0028]—种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0029]步骤一、将2_氯三苯甲基氯树脂加二氯甲烷浸泡，并震荡3〇min;树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂、N，N_二异丙基乙胺十倍过量于树脂加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应30min;然后加入甲醇孵育20min;封掉树脂上的反应活性位点；用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇.3%的抗坏血酸溶液、6〇%的苯酸溶液各一滴，同时加热至l〇5°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0030]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂，同时加入缩合试剂苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，与树脂上氨基酸进行缩合，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0031]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入体积比为94•5:1:2•5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯水组成的裂解液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；所述切割液为：三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;[0032]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪HPLC上梯度淋洗纯化，冻千即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存;HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为0•1%三氟乙酸的水溶液A和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5min，A9〇%，B10%;3〇min，A6〇%，B40%，3〇.l〇min停止。得到的环肽纯品的收率为80.2%，纯度为95.6%;进行检测£31-]\^:[211-11]+=619.23。[0033]实施例2:[0034]—种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0035]步骤一、将2_氯三苯甲基氯树脂加二氯甲烷浸泡，并震荡30min;树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂、N，N-二异丙基乙胺十倍过量于树脂加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应3〇min;然后加入甲醇孵育2〇min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上;去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇.3%的抗坏血酸溶液、6〇%的苯酚溶液各一滴，同时加热至110。：并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并己裸露出不带保护的氨基;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0036]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带二苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂，同时加入缩合试剂2_7_偶氮苯并三氮挫-四甲基脲六氟磷酸酯三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N_甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，与树脂上氨基酸进行缩合;反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗漆树脂各两遍后除去溶剂，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0037]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂苯并三氮唑-N,N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入体积比为94•5:1:2•5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯水组成的裂解液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；所述切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为1%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;[0038]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪HPLC上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存;HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为0•1%三氟乙酸的水溶液A和0•1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5min，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30.10min停止。得到的环肽纯品的收率为80.5%，纯度为95.5%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.25。[0039]实施例3:[0040]—种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0041]步骤一、将氯二苯甲基氯树脂加二氯甲烧浸泡，并震荡30min;树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂、N,N-二异丙基乙胺十倍过量于树脂加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应30min;然后加入甲醇孵育20min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上;去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇.3%的抗坏血酸溶液、60%的苯酚溶液各一滴，同时加热至ll〇°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0042]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂，同时加入缩合试剂1-羟基苯并三氮唑三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，与树脂上氨基酸进行缩合;反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含2〇%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0043]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂苯并三氮唑-N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入体积比为94.5:1:2.5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯水组成的裂解液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；所述切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;[0044]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪HPLC上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存;HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为0•1%三氟乙酸的水溶液A和0•1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5min，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30.10min停止。得到的环肽纯品的收率为81.2%，纯度为95.8%;进行检测£51-^18:[2^«-田+=619.24。[0045]实施例4:[0046]所述步骤一中，在震荡反应之前将带保护基的半胱氨酸、N，N_二异丙基乙胺、树脂和DMF加入超临界反应装置中，在体系密封后通入二氧化碳至25MPa，搅拌反应30min，搅拌速度为lOOr.min1。其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为83•5°乂，纯度为97.8%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.24。[0047]实施例5:[0048]所述步骤一中，在震荡反应之前将带保护基的半胱氨酸、N，N_二异丙基乙胺、树脂和DMF加入超临界反应装置中，在体系密封后通入二氧化碳至40MPa，搅拌反应45min，搅拌速度为UOr.min1。其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为84•1%，纯度为97•6%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.23。[0049]实施例6:[0050]所述步骤三中，完成环化反应后，将产物料加入密封容器中，密封，然后置于2•5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为50Gy.mirT1，辐照剂量为2〇KGy，搅拌速度为lOOr.miiT1。其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为86•5%，纯度为98.5%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.23。[0051]实施例7:[0052]所述步骤三中，完成环化反应后，将产物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为lOOGy.mirT1，辐照剂量为l〇KGy，搅拌速度为150r.min'其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为86•8%，纯度为98.7%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619•24。[0053]实施例8:[0054]所述步骤三中，完成环化反应后，将产物料加入密封容器中，密封，然后置于2•5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为lOOGy.miiT1，辐照剂量为2〇KGy，搅拌速度为UOr.mirT1。其余工艺参数和过程与实施例5中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为89•5%，纯度为99•7%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619•25。[0055]实施例9:[0056]所述步骤四中，冻千的过程为:将纯化后的环肽置于真空冷冻干燥机内进行预冷泺，攻足预令乐温度为-10°C，干燥机内温度下降的速度为〇.5»C.min-i，到达设定温度后保温lOmin;然后开启干燥机的抽真空装置进行抽真空处理，使干燥机内的气压介于2〇Pa，且将干燥机干燥温度设定在-60°C，保温lh;保持干燥机的真空压力，开启干燥机的加热装置，使干燥温度以1°C_min1的速度上升到25°C，保温lh;停止干燥机的抽真空处理，向干燥机内缓慢充入氮气，直至干燥机内的气压介于〇.1〇〜〇.11MPa之间并保压10min，再释放至常压完成干燥过程。其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为82•5%，纯度为96•5%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.24。[0057]实施例10:[0058]所述步骤四中，冻干的过程为:将纯化后的环肽置于真空冷冻干燥机内进行预冷冻，设定预冷冻温度为-20°C，干燥机内温度下降的速度为i.min-1，到达设定温度后保温30min;然后开启干燥机的抽真空装置进行抽真空处理，使干燥机内的气压介于5〇Pa，且将干燥机的干燥温度设定在-so°c，保温3h;保持干燥机的真空压力，开启干燥机的加热装置，使干燥温度以2°C•min_1的速度上升到30°C，保温3h;停止干燥机的抽真空处理，向干燥机内缓慢充入氮气，直至干燥机内的气压介于0•10〜0•1IMPa之间并保压20min，再释放至常压完成干燥过程。其余工艺参数和过程与实施例1中的完全相同。得到的环肽纯品的收率为82•8%，纯度为96.8%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.24。[0059]实施例11:[0060]—种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0061]步骤一、将4-甲苯氢胺树脂加二氯甲烷浸泡，并震荡30min;树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂、N，N-二异丙基乙胺十倍过量于树脂加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应30min;然后加入甲醇孵育20min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上；去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇.3%的抗坏血酸溶液、60%的苯酚溶液各一滴，同时加热至110°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0062]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂，同时加入缩合试剂i-羟基苯并三氮唑三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，与树脂上氨基酸进行缩合;反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5tnin，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0063]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂苯并三氮唑-N,N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应3〇min，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入体积比为94.5:1:2.5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和纯水组成的裂解液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙酿丨几降罔;L、，再用乙酿洗潘丨几降物3次，然后常温挥发至干，得到环狀粗品；所述切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;[0064]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪HPLC上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存;HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为0•1%三氟乙酸的水溶液A和0•1%三氟乙酸的乙腈溶液b，淋洗条件设置:5min，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30_10min停止。得到的环肽纯品的收率为8〇%，纯度为94_5%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=618.55。[0065]实施例12:[0066]—种均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，包括：[0067]步骤一、将Wang树脂加二氯甲烷浸泡，并震荡3〇min;树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂、N，N-二异丙基乙胺十倍过量于树脂加入树脂中，再加入DMF使之溶解，室温下震荡反应3〇min;然后加入甲醇孵育20min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上;去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、0.3%的抗坏血酸溶液、60%的苯酚溶液各一滴，同时加热至110°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其竣基;所述去除保护基荷甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0068]步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸三倍摩尔过量于树脂，同时加入缩合试剂1-轻基苯并三氮唑三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，与树脂上氨基酸进行缩合;反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰;所述去除保护基芴甲氧羰酰基时，加入的裂解液为含20%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂；[0069]步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来;用旋转蒸发仪除去切割液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂苯并三氮唑_N，N，N’，N’_四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min，完成环化反应;采用旋转蒸发仪除去溶剂，加入体积比为94.5:1:2.5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯水组成的裂解液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至千，得到环肽粗品；所述切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应1〜2h;[0070]步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪HPLC上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20°C保存；HPLC采用的色谱柱为反相C18制备柱，淋洗液为〇•1%三氟乙酸的水溶液A和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5min，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30.10min停止。得到的环肽纯品的收率为?8%，纯度为93.5%;进行检测ESI-MS:[2M-H]+=619.25[0071]尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，比如环的大小、环上氨基酸的修饰等，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

权利要求：1.一种均环肽Cycl〇-cys6的制备方法，其特征在于，包括：步骤一、将树脂溶胀后除去溶剂，取氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸、N，N-二异丙基乙胺DIEA加入树脂中，再加入二甲基甲醜胺DMF使之溶解，室温下震荡反应30〜60min;然后加入甲醇孵育20min;用DMF和甲醇溶剂反复清洗树脂并抽掉溶剂，第一个氨基酸连接在树脂上;去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基;取样检测确保氨基酸己经连接在树脂上，且已裸露出不带保护的氨基；#步骤二、在步骤一得到的产物中再次加入氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半肮氨酸，同时加入缩合试剂，与树脂上氨基酸进行缩合，然后去掉溶剂后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰基，取样检测后，再重复四次上述操作，直至半胱氨酸偶联完全，脱除最后一个半胱氨酸氨基上的保护基芴甲氧羰酰；步骤三、在步骤二得到的产物中加入切割液，将缩合好的直链肽从树脂上切割下来；用旋转蒸发仪除去切液，得到带保护的肽段;用二氯甲烷将带保护的肽段溶解，加入环化试剂，完成环化反i应;采用旋转蒸发伩除去溶剂，加入裂解液，脱除巯基上的三苯甲基保护基；用冰乙醚沉降离心，再用乙醚洗涤沉降物3次，然后常温挥发至干，得到环肽粗品；’步骤四、将得到的环肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色谱仪上梯度淋洗纯化，冻干即可得到白色粉末状的环肽纯品，密封包装，-20X：保存。一2.如权利要求1所述的均环肽Cycl〇-Cyss的制备方法，其特征在于，所述树脂为2一氯三苯甲基氯树脂、4-甲苯氢胺树脂、Wang树脂中的任意一种，所述溶胀的条件为加二氯甲烷DCM浸泡，并震荡30min;其中半胱氨酸与树脂连接的位置为其羧基；所述步骤jP步骤二中，取样检测的方法为：取几粒树脂，用乙醇充分清洗后，加入体积分数5%的茚三酮乙醇溶液、〇•3%的抗坏血酸溶液、㈤％的苯酚溶液各一滴，同时加热至105〜110°C并保温5min，如果树脂颜色变为深蓝色，则说明氨基酸已经连接在树脂上，并已裸露出不带保护的氨基。3.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤一和步骤二中，每次所加入的氨基带芴甲氧羰酰基保护基和侧链巯基带三苯甲基保护基的半胱氨酸的用量均三倍摩尔过量于树脂;所述步骤一和步骤二中，去除保护基芴甲氧羰酰基时，力口入的裂解液为含2〇%哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往复约4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分别洗涤两次，去除溶剂。'4.如权利要求1^述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤二中，半胱氨酸之间的缩合，采用的试剂及反应条件为:加入缩合试剂三倍摩尔过量，均用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量或N，N—二异丙基碳二亚胺三倍摩尔过量，反应3toiin，反应后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗涤树脂各两遍后除去溶剂;所述缩合试剂为苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲六氟磷酸酯、1-轻基苯并三氮唑、2-7-偶氮苯并三氮唑）一四甲基脲六氟磷酸酯、0-苯并三氮唑-N，N，N’，N’-四甲基脲四氟硼酸中的任意一种。5.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，将直链肽从树脂上切割下来时所选用切割液为:三氟乙酸和二氯甲烷组成的混合溶剂，其中三氟乙酸的体积分数为1〜2%，切割条件为加入切割液后常温孵育反应丨〜〗}!;所述步骤三中，直链肽环化的反应条件为:加入环化试剂苯并三氮唑—N，N，N’，N，—四甲基脲六氟磷酸酷基三倍摩尔过量，用DMF溶解，然后立刻加入加入N-甲基吗啡啉十倍摩尔过量，反应30min。6.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，裂解液为为体积比为94•5:1:2.5:2的三氟乙酸、三异丙基硅烷、1，2-乙二硫醇和纯水组成的混合液，反应条件为加入裂解液后孵育反应2〜3h。7.如权利要求1所述的均环肽Cyc1o-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤四中环肽的纯化阶段，HPLC采用的色谱柱为反相CIS制备柱，淋洗液为O.i%三氟乙酸的水溶液A和0.1%三氟乙酸的乙腈溶液B，淋洗条件设置:5min，A90%，B10%;30min，A60%，B40%，30.lOmin停止。8.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤一中，在震荡反应之前将带保护基的半胱氨酸、N，N-二异丙基乙胺、树脂和DMF加入超临界反应装置中，在体系密封后通入二氧化碳至25〜40MPa，搅拌反应30〜45min，搅拌速度为100〜150r.min_1〇9.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤三中，完成环化反应后，将产物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的电子加速器中进行辐照搅拌处理，辐照剂量率为5〇〜l〇〇Gy.mirT1，辐照剂量为1〇〜20KGy，搅拌速度为100〜150r.mirf1。10.如权利要求1所述的均环肽Cyclo-Cys6的制备方法，其特征在于，所述步骤四中，冻干的过程为:将纯化后的环肽置于真空冷冻干燥机内进行预冷冻，设定预冷冻温度为一10〜_2〇°C，干燥机内温度下降的速度为0_5〜l°C.min_1，到达设定温度后保温1〇〜3〇min;然后开启干燥机的抽真空装置进行抽真空处理，使干燥机内的气压介于20〜50Pa，且将干燥机的干燥温度设定在-60〜-80°C，保温1〜3h;保持干燥机的真空压力，开启干燥机的加热装置，使干燥温度以1〜2°C.mirT1的速度上升到25〜3TC，保温1〜3h;停止千燥机的抽真空处理，向干燥机内缓慢充入氮气，直至干燥机内的气压介于〇•10〜〇•llMPa之间并保压10〜20min，再释放至常压完成干燥过程。

百度查询： 中国工程物理研究院核物理与化学研究所 均环肽Cyclo-(Cys)₆的制备方法