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申请/专利权人：中国农业大学

摘要：本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及PUB25基因在调控植物耐低温性能中的应用。本发明发现PUB25基因具有调控植物耐低温性能的功能，将PUB25基因在拟南芥中过表达，所获得的转基因植物相较于野生型拟南芥表现出显著的耐低温表型。PUB25蛋白及其编码基因可在实践中用于耐低温植物品种的培育和鉴定，为培育耐低温植物新品种提供了基因资源和新方法。

主权项：1.PUB25蛋白或其编码基因在调控植物耐低温性能中的应用，所述PUB25蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，所述植物为拟南芥。

全文数据：PUB25基因在调控植物耐低温性能中的应用技术领域本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及PUB25基因在调控植物耐低温性能中的应用。背景技术植物的生长发育过程中面临着来自周围环境的各种生物胁迫和非生物胁迫，温度是影响植物的生长发育过程和地理分布的重要环境因素之一。在长期的进化过程中，植物为了适应环境变化建立起复杂的信号调控网络。随着近年来全球气候的剧烈变化，低温寒害作为一种自然灾害，对植物的细胞功能和正常生长带来严重破坏，极大地限制粮食作物的产量，危害全球粮食安全。因此，研究植物响应低温信号的分子机制，寻找植物调控低温应答的关键组分，进而培育抗低温的粮食作物品种，具有重要的科学意义和生产价值。发明内容为解决现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供PUB25基因在调控植物耐低温性能中的应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下：本发明发现拟南芥ArabidopsisthalianaE3连接酶蛋白PUB25的编码基因PLANTU-BOX25具有调控植物响应低温胁迫的功能，过表达PUB25的转基因植株表现出明显的抗冻表型。第一方面，本发明提供PUB25蛋白或其编码基因在调控植物耐低温性能中的应用。第二方面，本发明提供PUB25蛋白或其编码基因在提高植物在低温胁迫后的存活率中的应用。第三方面，本发明提供PUB25蛋白或其编码基因在培育耐低温植物中的应用。第四方面，本发明提供PUB25蛋白或其编码基因在构建耐低温转基因植物中的应用。上述PUB25蛋白或其编码基因的应用可以PUB25蛋白或其编码基因本身的形式应用，或者以含有PUB25基因的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有PUB25基因的转基因植物细胞系的形式应用。本发明中，所述PUB25蛋白的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；2如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；3与如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。哥伦比亚生态型的拟南芥E3连接酶蛋白PUB25的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，由421个氨基酸残基组成。本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列以及氨基酸的保守性替换等本领域常规技术手段，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和或增加一个或几个氨基酸，得到所述PUB25蛋白的突变体。哥伦比亚生态型的拟南芥E3连接酶蛋白PUB25的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，由1266个碱基组成，在拟南芥基因组数据库中的编号为At3g19380，该基因的读码框为自5’端第1位到第1266位碱基，没有内含子。本发明所述的PUB25编码基因可以为任意能够编码上述PUB25蛋白的核苷酸序列。考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本发明中，所述PUB25编码基因的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；2如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经替换、缺失或插入一个或多个碱基得到的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；3在严格条件下能够与如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。本发明通过实验证实，将PUB25基因在植物中过表达后，植物表现出明显的耐低温表型。第五方面，本发明提供一种提高植物耐低温性能的方法，其为通过在所述植物中过表达PUB25基因，提高植物的耐低温性能。上述过表达PUB25基因中，PUB25基因的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；2如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经替换、缺失或插入一个或多个碱基得到的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；3在严格条件下能够与如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。所述过表达PUB25基因可通过本领域常规技术手段实现。作为优选，所述过表达PUB25基因为在所述植物中导入携带PUB25编码基因的表达载体。作为本发明的一种优选实施方式，在进行PUB25基因过表达时，所述PUB25基因由35S启动子调控转录。作为本发明的一种优选实施方式，所述表达载体为pCAMBIA1300。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物等。本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于拟南芥、玉米、水稻、棉花、大豆等。第六方面，本发明还提供一种构建抗低温拟南芥的方法，其为：将所述PUB25基因在拟南芥植株中过表达，获得抗低温的拟南芥。所述拟南芥植株优选为拟南芥野生型植株，即具有纯合基因型的拟南芥植株。第七方面，本发明还提供用于扩增所述PUB25基因的特异性引物对。具体地，所述用于扩增所述PUB25基因的特异性引物对的序列如下：上游引物：5’-ATGCCTAGGAATATAGAACC-3’如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；下游引物：5’-TCAAAAAGGGACCACTTGGC-3’如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。本发明的有益效果在于：本发明发现了PUB25基因具有调控植物耐低温性能的功能，通过实验证明，将PUB25基因在拟南芥中过表达，所获得的转基因植物相较于野生型拟南芥表现出显著的耐低温表型。PUB25蛋白及其编码基因可在实践中用于耐低温植物品种的培育和鉴定，为培育耐低温植物新品种提供了基因资源和新方法。附图说明图1为本发明实施例1中过表达株系PUB25-Flag中的PUB25蛋白检测结果图，其中col为野生型植株，PUB25-Flag为PUB25基因过表达转基因植株。图2为实施例2中过表达株系PUB25-Flag冷锻炼和非冷锻炼后低温处理植株生长恢复情况的照片，其中，Control为未经低温处理的幼苗，FreezingNA为非冷锻炼低温处理组，FreezingCA为冷锻炼低温处理组。图3为实施例2中过表达株系PUB25-Flag冷锻炼和非冷锻炼后低温处理植株的成活率统计结果图，其中，NA为非冷锻炼低温处理组，CA为冷锻炼低温处理组；Col为野生型植株，PUB25-Flag为PUB25基因过表达转基因植株。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中pUC19-35S-FLAG-RBS质粒可市购；pCAMBIA1300为常用的克隆载体，可市购；拟南芥品种为哥伦比亚生态型；农杆菌GV3101菌株为常用的克隆载体。以下实施例中的主要试剂如下：各种限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶、KOD等购自于TAKARA大连、NEB、Toyobo等生物公司；dNTPs购自于Genestar公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒购自于上海捷瑞生物工程公司；MS培养基，琼脂粉，琼脂糖，氨苄青霉素Amp、卡那霉素Kan、硫酸庆大霉素Gen、利福平Rif等抗生素及LBMedium等购自Sigma；硝酸纤维素膜购自Bio-Rad等公司；实施例中所使用的各种其它化学试剂均为进口或国产分析纯试剂。以下实施例中所使用的引物由六合华大公司合成，并进行相关测序。实施例1PUB25基因过表达植株的构建与筛选PUB25基因过表达植株的构建与筛选的具体方法如下：1、从拟南芥属拟南芥ArabidopsisthalianaL.HEYNH.中克隆编码植物E3连接酶蛋白的基因PUB25，连接到具有35S启动子的过表达载体pCAMBIA1300上。根据编码区序列分析PUB25基因的序列如SEQIDNO.2所示，设计引物扩增PUB25基因的编码区。提取拟南芥的总RNA，经反转录获得cDNA，以拟南芥cDNA为模板，利用上游引物和下游引物扩增PUB25基因，PUB25基因的扩增引物如下：上游引物：5’-ATGCCTAGGAATATAGAACC-3’如SEQIDNO.3所示的核苷酸序列；下游引物：5’-AAAAGGGACCACTTGGC-3’如SEQIDNO.4所示的核苷酸序列。将扩增得到的PUB25基因PCR产物总长1263bp，不包含终止密码子连接到具有35S启动子的载体pCAMBIA1300上，具体方法如下：1用T4连接酶将PCR产物与pUC19-35S-Flag载体相连，连接产物命名为PUB25-pUC19-Flag；2利用KpnI和BstbI酶切PUB25-pUC19-Flag载体得到PUB25-Flag，连入pCAMBIA1300载体，连接产物命名为PUB25-pCAMBIA1300-Flag。3将步骤2所得的PUB25-pCAMBIA1300-Flag质粒用KpnI和BstbI酶切，利用1％的琼脂糖凝胶，120V，50mA电泳，UVPGelDocumentation凝胶分析系统扫描成像。经酶切鉴定成功后，将质粒测序，待测序正确后进行下一步试验。2、将正确构建的PUB25-pCAMBIA1300-Flag载体利用电击转化法转化到农杆菌GV3101菌株中，再将含上述载体的阳性单克隆菌转化到拟南芥野生型植株中，得到拟南芥转基因幼苗，具体的方法如下：1将含有PUB25-pCAMBIA1300-Flag载体的农杆菌接种于100mLLB三抗液体培养液Kan50μgmL，Rif50μgmL，Gen50μgmL中，28℃振荡培养过夜OD600至1.0-2.0；4000rpm，室温离心15min，收集菌体；用100mL转化液12MS，5％蔗糖，40μLSilwetL-77悬浮菌体，调整菌体浓度OD600至1.0；2将拟南芥花序浸泡在农杆菌的转化液中1min左右后取出，套上保鲜袋保湿并将植物置于黑暗处避光过夜，12h后将植物取出放置于光照培养架上正常生长至收种。上述pCAMBIA1300载体所携带筛选抗性基因为潮霉素，用潮霉素抗性对拟南芥转基因幼苗进行筛选获得纯合转基因植物。具体方法如下：将上述获得的T1代具有潮霉素抗性的阳性苗进行单株收种得到T2代；对T2代种子进行潮霉素抗性的测试，选择34具有抗性而14没有抗性的株系，说明在该株系中含有目的基因的过表达载体以单拷贝形式插入；将上述株系中具有潮霉素抗性的植株移出，再进行单株收种得到T3代；对T3代种子进行潮霉素抗性筛选，选择没有分离的纯合转基因株系。该纯合体可以用于繁种、低温逆境处理实验。经上述转化和筛选得到过表达PUB25基因的拟南芥纯合株系PUB25-Flag。采用蛋白质免疫印迹方法检测所得PUB25基因过表达株系中PUB25-Flag的蛋白表达情况。具体方法如下：提取野生型WT、PUB25-Flag转基因植株总蛋白；测定所提取样品蛋白浓度并调整样品总蛋白量一致30μg；利用蛋白质免疫技术检测过表达植株中PUB25蛋白含量，Anti-Flag抗体用于检测PUB25-Flag蛋白，Anti-Actin抗体用于检测内参蛋白Actin。蛋白质免疫印迹的检测结果如图1所示，结果显示，PUB25基因过表达株系中能检测到带标签的PUB25-Flag蛋白，野生型植株中未检测到PUB25-Flag蛋白。在其它植物中过表达PUB25蛋白的方法可以参考本实施例进行。实施例2过表达PUB25的转基因植物的抗低温能力检测首先将拟南芥野生型幼苗和实施例1中制备得到的PUB25基因过表达株系在12MS固体培养基上培育，各20份材料。幼苗生长14d后，将野生型幼苗和PUB25基因过表达株系的幼苗分别分为两组，每组10份材料。在进行低温处理前，对幼苗进行拍照记录，记为Control。第一组，对非冷锻炼NA的幼苗进行低温处理，程序设定为0℃至-5℃梯度降温每小时降低1℃，处理至-5℃运行1h后取出。第二组，将幼苗放置4℃培养箱中冷锻炼48hCA，之后进行低温处理，程序设定为0℃至-10℃梯度降温每小时降低1℃，处理至-10℃运行1h后取出。将上述第一组和第二组经低温处理后的幼苗转移至4℃黑暗条件放置12h使其培养基缓慢解冻，之后在正常光照条件下培养3-4d，在此期间，低温中受伤的组织会在培养过程中黄化枯死，而能够抵抗低温伤害的植株逐渐变绿并恢复生长，拍摄照片并统计成活率SurvivalRate。PUB25过表达株系及对照野生型株系，在冷锻炼和非冷锻炼后低温处理后的表型如图2所示；存活率统计结果如图3所示。实验结果表明，在冷锻炼和非冷锻炼条件下，PUB25过表达植株相较于野生型植株均表现出明显的抗低温表型。虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。序列表中国农业大学PUB25基因在调控植物耐低温性能中的应用KHP191113467.34SIPOSequenceListing1.01421PRT人工序列ArtificialSequence1MetProArgAsnIleGluProLeuAspLeuGlyIleGlnIleProTyr151015HisPheArgCysProIleSerLeuGluLeuMetGlnAspProValThr202530ValCysThrGlyGlnThrTyrAspArgAlaSerIleGluSerTrpVal354045SerIleGlyAsnAsnThrThrCysProValThrArgAlaProLeuSer505560AspPheThrLeuIleProAsnHisThrLeuArgArgLeuIleGlnGlu65707580TrpCysValAlaAsnArgSerAsnGlyValGluArgIleProThrPro859095LysGlnProAlaAspProThrSerValArgAlaLeuLeuSerGlnAla100105110SerAlaIleThrGlyThrHisValSerValArgSerArgAlaAlaAla115120125LeuArgArgLeuArgGlyPheAlaArgAspSerAspLysAsnArgVal130135140LeuIleAlaAlaHisAsnAlaThrGluIleLeuIleLysIleLeuPhe145150155160SerGluThrThrSerSerGluLeuValSerGluSerLeuAlaLeuLeu165170175ValMetLeuProIleThrGluProAsnGlnPheValSerIleSerSer180185190AspProGlyArgValGluPheLeuThrArgLeuLeuPheAspSerSer195200205IleGluThrArgValAsnAlaAlaAlaLeuIleGluIleValSerThr210215220GlyThrLysSerAlaAspLeuLysGlySerIleSerAsnSerGluSer225230235240ValPheGluGlyValLeuAspLeuLeuArgAsnProIleSerSerArg245250255ArgAlaLeuLysIleGlyIleLysThrLeuPheAlaLeuCysSerVal260265270LysSerThrArgHisIleAlaIleThrAlaGlyAlaProGluIleLeu275280285IleAspArgLeuAlaAlaAspPheAspArgCysAspThrGluArgAla290295300LeuAlaThrValGluLeuLeuCysArgThrProGluGlyCysAlaAla305310315320PheGlyGluHisAlaLeuThrValProLeuLeuValLysThrIleLeu325330335ArgValSerAspArgAlaThrGluTyrAlaAlaGlyAlaLeuLeuAla340345350LeuCysThrAlaGluGluArgTrpArgGluGluAlaAlaGlyAlaGly355360365ValValValGlnLeuLeuLeuMetValGlnSerGluCysThrGluArg370375380AlaLysLysLysAlaGlnLysLeuLeuLysLeuLeuArgAspSerTrp385390395400ProAspTyrAsnSerPheAlaAsnSerAspAspPheGlyCysSerSer405410415GlnValValProPhe42021266DNA人工序列ArtificialSequence2atgcctaggaatatagaaccattggatcttggaatccaaataccatatcatttcagatgt60ccaatatcactcgaacttatgcaagacccagtcaccgtctgcaccggccaaacctacgac120cgagccagcatcgagtcatgggtctccatcggtaacaacacgacatgtccagtcacacga180gctcctctctccgacttcacactcatccctaaccacactctccgtcgtctcatccaagaa240tggtgcgtcgctaaccgctccaatggagtcgaacgtatccctactcctaaacaaccagct300gatccaacctctgttcgtgctcttctcagtcaagcctctgctataacaggaacccacgtc360tctgttcgttcacgcgccgccgctctccgccgtttacgtggtttcgctcgtgattctgat420aaaaatcgcgttttgatcgcagctcataacgctacagagattttgattaagattctgttc480tctgaaacgacgtcgtcggagttagtctctgagtctttagctctacttgttatgttaccg540ataacggagccgaaccagtttgtttcgatatcgtcggatccgggtcgggtcgagtttttg600acccggttgttattcgattcgtcgattgaaacacgcgttaacgccgccgcgttgatcgag660attgtttcgacgggaaccaaatcggcggacctgaaaggttcgatttcgaattcagaatct720gtattcgaaggagttctcgatcttctgagaaatccgatttcgtcacgacgagctctcaaa780atcggaatcaaaactctgttcgcgctctgttcagtgaaatcgacgcgacacatcgcgatc840acagccggtgcgccggagattctaatagacagactcgcggcggatttcgatagatgcgat900acggagcgagccttagcgacggtggagctactctgccgaacgccggaaggatgcgcggcg960ttcggtgagcacgctttaacggtgccgttgttagttaaaacgatattgagagtttcggat1020cgcgcgacggagtatgcggcgggggcgttgttagcgctttgtacggcggaggaaaggtgg1080agggaggaagcggcgggggcgggagtggtggtacagttgttgttgatggtgcagagtgag1140tgtacggagagagcgaagaagaaagcacagaagttattgaagcttctgagagattcatgg1200cctgactacaattccttcgctaactccgatgactttggttgcagcagccaagtggtccct1260ttttga1266320DNA人工序列ArtificialSequence3atgcctaggaatatagaacc20420DNA人工序列ArtificialSequence4tcaaaaagggaccacttggc20

权利要求：1.PUB25蛋白或其编码基因在调控植物耐低温性能中的应用。2.PUB25蛋白或其编码基因在提高植物在低温胁迫后的存活率中的应用。3.PUB25蛋白或其编码基因在培育耐低温植物中的应用。4.PUB25蛋白或其编码基因在构建耐低温转基因植物中的应用。5.根据权利要求1～4任一项所述的应用，其特征在于，所述PUB25蛋白的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；2如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列经替换、缺失或插入一个或多个氨基酸得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；3与如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列具有至少90％同源性且具有相同功能蛋白的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述PUB25编码基因的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；2如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经替换、缺失或插入一个或多个碱基得到的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；3在严格条件下能够与如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。7.一种提高植物耐低温性能的方法，其特征在于，在所述植物中过表达PUB25基因；所述PUB25基因的序列为如下任意一种：1如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列或其互补序列；2如SEQIDNO.2所示的核苷酸序列经替换、缺失或插入一个或多个碱基得到的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；3在严格条件下能够与如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述过表达PUB25基因为在所述植物中导入携带PUB25基因的表达载体。9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述PUB25基因由35S启动子调控转录。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA1300。

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