买专利卖专利找龙图腾，真高效！ 查专利查商标用IPTOP,全免费！专利年费监控用IP管家,真方便！

申请/专利权人：辽宁大学

摘要：本发明公开了蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的构建方法及其应用。本发明构建出了含有Nluc2A报告基因的报告病毒，使可以通过检测Nluc荧光素酶信号来监测TBEV、研究病毒毒力，并且可作为抗病毒药物筛选的有力工具。

主权项：1.蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：1SnaBI-C38片段的克隆：以TBEVFL为模板，引物1和引物2为特异性引物，PCR扩增蜱传脑炎病毒SnaBI-C38片段；所述引物1和引物2的序列为：引物1：5’-TACGTATTAGTCATCGCTATTAC-3’；引物2：5’-GTGTGAAGACCATCACGAGTCCATTTGGC-3’；2P2A序列和Nluc基因的连接：将P2A序列设计在引物上，并分两轮PCR将P2A序列连接到Nluc基因上；第一轮PCR：Nluc-pGEMT为模板，Nluc-F和P2ANlucR1为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；进行第二轮PCR：第一轮PCR回收的目的条带为模板，Nluc-F和P2ANlucR2为引物进行PCR，扩增好目的片段后，回收目的条带；将第二轮PCR回收的目的条带连接到pGEMT载体上，命名为Nluc2ApGEMT；所述引物Nluc-F、引物P2ANlucR1和引物P2ANlucR2的序列为：引物Nluc-F：5’-ATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；引物P2ANlucR1：5’-CAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCCGCCAGAATGCGTTCGCAC-3’；引物P2ANlucR2：5’-AGGTCCAGGGTTCTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAG-3’；3Nluc-P2A片段的克隆：以Nluc2ApGEMT为模板，引物3和引物4为特异性引物，扩增出Nluc-P2A片段；所述引物3和引物4的序列为：引物3：5’-CAAATGGACTCGTGATGGTCTTCACACTCGAAG-3’；引物4：5’-CTTCCCGGCCATAGGTCCAGGGTTCTCCTC-3’；4C1-AflⅡ片段的克隆：以TBEVFL为模板，引物5和引物6为特异性引物，扩增出C1-AflⅡ片段；所述引物5和引物6的序列为：引物5：5’-GAACCCTGGACCTATGGCCGGGAAGGCCATTC-3’；引物6：5’-CTTAAGCAACACTCCAGTCTGG-3’；5构建SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段：以引物1和引物6为特异性引物，以步骤1获得的SnaBI-C38片段、步骤3获得的Nluc-P2A片段和步骤4获得的C1-AflⅡ片段为模板，通过重叠延伸PCR，将三个片段连接在一起，得到SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段；6将SnaBI-C38-Nluc-P2A-C1-AflⅡ片段和TBEV的感染性克隆用SnaBI和AflⅡ双酶切，将酶切片段跑胶回收，再用T4连接酶进行连接，获得蜱传脑炎病毒报告病毒TBEVNluc2A。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 辽宁大学 蜱传脑炎病毒报告病毒TBEV Nluc 2A的构建方法及其应用