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申请/专利权人：北京农学院

摘要：本发明“一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9及其应用”，属于微生物技术领域。所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9的保藏号为CGMCCNo.14783。基于该菌株，本发明还提供包含该菌株的降解木质素纤维素的菌剂、生物降解剂、用于堆肥的制品、添加剂，以及使用该菌株的木质素纤维素生物降解方法、堆肥的制备方法、生产锰过氧化物酶的方法。本发明的YZC9菌株的锰过氧化物酶MnP活性可高达116Uml；同时该密孔菌株YZC9还可获得良好的堆肥效果，具备工业化生产锰过氧化物酶MnP以及园林堆肥的良好应用前景。

主权项：1.一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCCNo.14783。

全文数据：一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9及其应用技术领域本发明属于微生物领域，具体涉及一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9及其应用。背景技术密孔菌属Pycnoporussp.是多孔菌目多孔菌科的一种真菌，担子果1～多年生，非平伏，担子果无柄，菌盖木栓质；菌肉橙～红色，遇10％KOH变黑；菌丝系统为三系菌丝，有索状联合；子实层体管状、有时有囊状体，无刚毛。子实体单生，群生或叠生。密孔菌属的新菌株的发现目前报道的较少，具有功能的密孔菌菌株更是罕见。现有技术中已报道过一种可生产漆酶的血红密孔菌Pycnoporussanguineus菌株mk528，其保藏号为CGMCCNO.1124。血红密孔菌，属多孔菌科一种，是木栖腐生的中小型菇类，该菇类生长于低中海拔林区，生长期间约是在春夏两季之间。上述血红密孔菌Pycnoporussanguineus菌株mk528产生的漆酶酶活可达63Uml。然而，同时具备纤维素和木质素降解能力的密孔菌菌株本领域尚未报道。因此本领域亟需开发更多的具有新功能的密孔菌菌株。发明内容针对本领域的上述空白和需求，本发明开发得到一株可同时降解木质素和纤维素，且同时具备木质素过氧化物酶LiP、锰过氧化物酶MnP、漆酶Lac活性，以及滤纸酶、外切β-葡聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性的新密孔菌菌株YZC9，该菌株的锰过氧化物酶MnP活性尤其高，可达到116Uml。本发明的技术方案如下：一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCCNo.14783。用于降解木质素和或纤维素的菌剂，其包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。所述菌剂，还包括制备菌剂常用的辅料；优选地，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。一种木质素和或纤维素的生物降解剂，其包括权利要求1所述的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，和或，权利要求2或3所述的菌剂。一种木质素和或纤维素的生物降解方法，包括将保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9与木质素和或纤维素接触。将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9用于堆肥、或用于与一般农业废弃物秸秆类包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆、果园废弃物、园林绿化废弃物、牛羊马粪便接触。一种生产锰过氧化物酶的方法，包括：培养保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。所述培养指将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9置于产酶培养基中发酵培养；优选地，所述产酶培养基包含如下物质：葡萄糖10gL，酒石酸铵2mmolL，吐温800.05gL，KH2PO42gL，MgSO4·7H2O0.5gL，CaCl20.1gL，VB11mgL；含有如下成分的微量元素混合液：氨基乙酸0.5gL，MgSO4·7H2O3gL，NaCl1.0gL，CoSO40.1gL，CaCl2·2H2O0.1gL，FeSO4·7H2O0.1gL，ZnSO4·7H2O0.1gL，CuSO4·5H2O0.01gL，AlKSO42·12H2O0.01gL，H3BO30.01gL，Na2MoSO4·2H2O0.01gL，MnSO4·H2O0.1gL；pH4.5的醋酸缓冲溶液10mmolL优选地，所述培养条件为35℃，150rmin摇床中培养72h后再培养48h；优选地，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基用纱布过滤，将滤液于4℃，10000rmin离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。用于园林废弃物堆肥的制品，其特征在于，所述制品包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9；优选地，所述的制品，其特征在于，还包括用于园林废弃物堆肥的常规成分。用于园林废弃物堆肥的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。一种堆肥，其由堆肥物料中接种保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9发酵而得。所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣按体积比8∶2混合的混合物；优选地，在堆肥物料中按体积比0.5％的接种密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。一种堆肥的制备方法，包括：在堆肥过程中向堆肥物料接种保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣按体积比8∶2混合的混合物；优选地，按体积比0.5％接种量在堆肥物料中接种密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。本发明的有益效果在于：本发明从野外环境的腐殖土中分离得到一株菌株，通过ITS分子鉴定及其功能测定，包括降解木质素、降解纤维素、堆肥腐熟等试验，发现其是一株属于密孔菌Pycnoporussp.的新菌株，并将其命名为YZC9，同时发现该YZC9菌株同时具备木质素纤维素降解能力，并测定出其同时发挥具备木质素过氧化物酶LiP、锰过氧化物酶MnP、漆酶Lac活性，以及滤纸酶、外切β-葡聚糖酶和内切β-葡聚糖酶活性，其中以锰过氧化物酶MnP活性最高，在未经诱导以及未经工业扩大培养的前提下，仅在实验室发酵的粗制酶液中，该YZC9菌株的锰过氧化物酶MnP活性可高达116Uml；同时该密孔菌株YZC9还可获得良好的堆肥效果，具备工业化生产锰过氧化物酶MnP以及园林堆肥的良好应用前景。本发明获得如下基金项目：国家重点研发计划国家质量基础的共性技术研究与应用“主要农业废弃物提取加工与功效评价标准研究”2017YFF0207800的支持。菌种保藏名称：YZC9保藏号：CGMCCNo.14783分类命名：密孔菌拉丁名：Pycnoporussp.保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期：2017年9月27日说明书附图图1为葡萄糖标准曲线。图2为YZC9愈创木酚显色反应。图3为YZC9苯胺蓝脱色反应。图4为YZC9产LiP、MnP酶实验。图5为YZC9产Lac酶实验。图6为YZC9木质素分解酶活力。图7为YZC9刚果红透明圈实验结果。图8为YZC9滤纸降解实验结果。图9为YZC9纤维素分解酶活力。图10为YZC9堆肥温度的变化。图11为YZC9菌落形态。图12为YZC9的系统发育树。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，下述实施例只是说明性的，并不限制本发明保护范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。生物材料的来源分离菌种的土壤采集自鹫峰、怀柔林场月亮鞍山林下腐殖土。培养基分离培养基：PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基细菌、高氏1号培养基放线菌木质素降解菌筛选培养基：PDA-愈创木酚显色培养基、PDA-苯胺蓝脱色培养基纤维素降解菌筛选培养基：CMC-Na培养基、滤纸培养基上述培养基均具备本领域常规理解的含义，可从本领域的工具书中查询获知相应的培养基配方。第1组实施例、本发明的密孔菌株YZC9本组实施例提供一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCCNo.14783。在一些具体的实施例中，所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9还具有如下特征：菌落直径50～55mm，白色，局部表面橙色，稀疏絮状；背面浅褐色，无水溶性色素。营养菌丝初期无色，壁光滑，后期深褐色，壁明显粗糙，具分隔，分枝多，宽1.5～4.0μm；无锁状联合现象。第2组实施例、本发明的菌剂本组实施例提供一种用于降解木质素和或纤维素的菌剂。本组所有的实施例都具备如下特征：所述菌剂包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。在进一步的实施例中，所述菌剂还包括制备菌剂常用的辅料；在优选的实施例中，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。第3组实施例、本发明的生物降解剂本组实施例提供一种木质素和或纤维素的生物降解剂。在本组所有的实施例中，都具备如下共同特征：所述生物降解剂包括第1组实施例任一所述的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，和或，第2组实施例任一所述的菌剂。第4组实施例、本发明的生物降解方法本组实施例提供一种木质素和或纤维素的生物降解方法。本组实施例具备如下共同特征：所述生物降解方法包括将保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9与木质素和或纤维素接触。在一些具体的实施例中，所述生物降解方法的特征是，将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9用于堆肥、或用于与秸秆类农业废弃物、果园废弃物、园林绿化废弃物、动物粪便接触；具体地，所述秸秆类农业废弃物包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆；所述动物粪便包括牛马羊粪便。第5组实施例、本发明生产锰过氧化物酶的方法本组实施例提供一种生产锰过氧化物酶的方法。本组所有的实施例具备如下共同特征：所述方法包括：培养保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。一些实施例中，所述培养指将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9置于产酶培养基中发酵培养。在进一步的实施例中，所述产酶培养基包含如下物质：蛋白胨10gL、酵母膏10gL、NaCl5gL、CMC-Na5gL。在具体的实施例中，所述培养条件为35℃，150rmin摇床中培养72h后再培养48h；在优选的实施例中，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基于4℃，10000rmin离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。第6组实施例、本发明的堆肥本组实施例提供一种堆肥。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述堆肥由堆肥物料中接种保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9发酵而得。在一些实施例中，所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；在优选的实施例中，所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣体积比8∶2的混合物；在具体的实施例中，在堆肥物料中按体积比0.5％接种密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。第7组实施例、本发明堆肥的制备方法本组实施例提供一种堆肥的制备方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述制备方法包括：在堆肥过程中向堆肥物料接种保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。在一些实施例中，所述堆肥物料包括园林废弃物；所述园林废弃物选自：动物粪便、枯枝落叶、菇渣；在进一步的实施例中，所述园林废弃物优选为牛粪和菇渣体积比8∶2的混合物；在具体的实施例中，按体积比0.5％接种量在堆肥物料中接种密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。实验例、本发明的实验操作过程3实验方法3.1土壤菌种分离配制无菌水，将土样按10-3到10-7的浓度梯度溶解到无菌水中，充分溶解。然后吸取混合液接种在PDA培养基上，置于28℃下培养5～7d。3.2菌种形态鉴定与纯化根据形态初步判定真菌、细菌和放线菌，并接到各自专用培养基上，反复接种纯化直至获得纯菌株，备用。3.3木质素降解菌的筛选方法3.3.1PDA-愈创木酚平板显色反应将纯化后的菌种接于PDA-愈创木酚培养基平板上后,置28℃下培养5d,每天记录有无红棕色变色圈的产生及变色圈直径的大小,有红棕色圈者记为+,反之记为-。根据变色圈所产生的时间及变色圈的直径大小,检测出产Lac较高的菌株。3.3.2PDA-苯胺蓝平板脱色反应将纯化后的菌种接于PDA-苯胺蓝培养基平板上,并将平板置28℃下避光培养10d,记录蓝色培养基中有无退色圈的产生及退色圈直径的大小,有退色圈者记为+,反之记为-。根据退色圈产生的时间及退色圈的直径大小,检测出产MnP和LiP较高的菌株3.3.3产酶试验菌落边缘用打孔器打直径5mm孔,分别滴入数滴0.1molL用96％乙醇配制的α-萘酚紫色显色圈-Lac,现配的等量4％与1％焦酚混合液黄褐色显色圈-LiP、MnP。3.3.4酶活试验液体培养基于35℃，150rmin摇床中培养72h，取0.2ml接种于100ml产酶培养基产酶培养基：葡萄糖10gL，酒石酸铵2mmolL，吐温800.05gL，KH2PO42gL，MgSO4·7H2O0.5gL，CaCl20.1gL，VB11mgL；微量元素混合液70ml：氨基乙酸0.5gL，MgSO4·7H2O3gL，NaCl1.0gL，CoSO40.1gL，CaCl2·2H2O0.1gL，FeSO4·7H2O0.1gL，ZnSO4·7H2O0.1gL，CuSO4·5H2O0.01gL，AlKSO42·12H2O0.01gL，H3BO30.01gL，Na2MoSO4·2H2O0.01gL，MnSO4·H2O0.1gL；醋酸缓冲溶液10mmolLpH4.5定容到1L；中，相同条件下培养48h。每隔24h取样测定酶活，将培养好的液体发酵产酶培养基置于4℃，10000rmin离心机离心15min，取上清液，即粗制酶液，待用。木质素过氧化物酶活性的测定——藜芦醇法锰过氧化物霉活性的测定——Mn2+法漆酶活性的测定——ABTS法3.4纤维素降解菌的筛选方法3.4.1CMC-Na水解圈测定法a.将所有的菌种接种在CMC-Na培养基中，两个重复，根据不同类型的菌种，调整不同的培养温度，培养不同的时间后，待菌种长的完整.b.打开盖子平摊在桌子上，用移液枪移取10ml的0.1％的刚果红溶液至每一个平板中，使其均匀的平铺在菌种上，静置染色30分钟，倒掉多余的刚果红溶液。c.取10ml1molL的氯化钠溶液至每个平板上，静置脱色1小时后，倒掉多余的液体。d.观察并测量透明圈与菌种直径，并拍照。e.计算DP值透明全大小D与菌种大小d的比值的平方3.4.2滤纸降解实验法将菌种接种在滤纸培养基中，做两个重复，并有一组无菌水的对照。按照培养条件，培养一段时间后，每两天一观测滤纸的降解程度，并拍照记录。3.4.3纤维素降解菌酶活的测定方法3.4.3.1材料DNS试剂、产酶培养基蛋白胨10gL酵母膏10gLNaCl5gLCMC-Na5gL、0.05molL柠檬酸缓冲液、0.1molL柠檬酸钠溶液、0.05molL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、1％CMC溶液3.4.3.2葡萄糖标准曲线的绘制用分析天平称取0.108g葡萄糖试剂于100ml烧杯中，随后加入蒸馏水定容至100ml，使其充分溶解后，按下列表格表1，利用移液枪移取不同量的葡萄糖、蒸馏水以及DNS试剂于十只洗干净的试管中，充分摇匀后，放入吸光光度计进行吸光值的测定。利用excel录入数据，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，得到标准曲线方程如图1。表1葡萄糖标准曲线参考表3.4.3.3酶活测定方法3.4.3.3.1制备粗酶液a.选出刚果红和滤纸实验效果好的菌种，分别接在200ml的真菌、细菌、放线菌的液体培养基中，培养1-2天后，用移液枪取2ml的液体培养基中的菌液，接种在100ml的产酶培养基中，一个菌种做21个重复。根据真菌、细菌、放线菌不同的培养时间、培养温度于150rmin的摇床中进行培养，以备之后七天的酶活测定实验。b.每天一种菌种取三瓶作为三个重复，分别倒入15ml离心管中进行离心，离心转数为1400rmin,时间为15min,离心后取5ml于小锥形瓶中，加入45ml蒸馏水稀释10倍。3.4.3.3.2滤纸酶活力的测定每种菌种在测量时，取4只20ml的试管，加入50mg的去淀粉滤纸，随后加入1.5ml0.05molL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热1h后，加入1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。3.4.3.3.3外切β-葡聚糖酶酶活力的测定取4只20ml的试管，加入50mg的脱脂棉，随后加入1.5ml0.05molL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热1h后，加入1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。3.4.3.3.4内切β-葡聚糖酶酶活力的测定取4只20ml的试管，加入含有1％CMC的1.5ml0.05molL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，取稀释后的粗酶液0.5ml于三个试管中为三个重复,另外一个试管中加入0.5ml蒸馏水作为测吸光值时的调零溶液，50度水浴加热30min后，加入1.5mlDNS试剂以终止反应，再沸水浴5min,待其冷却后，加入蒸馏水定容至20ml，之后测吸光值并记录。真菌在培养48h后开始测定，细菌在培养24h后开始测定，共测定七天。3.4.3.3.5酶活力计算通过所得到的吸光值，带入到葡萄糖标准曲线中，计算出葡萄糖的含量，随后利用下面的公式进行计算，得到酶活力。酶活力Uml＝葡萄糖含量mg×酶液定容总体积ml×1000反应液中酶液加入量ml×反应时间min3.5堆肥实验将牛粪和菇渣按体积比8∶2进行混合，同时加入菌并搅拌均匀，堆在1m3的发酵池中，接种量为体积比0.5％，之后进行堆肥发酵，堆肥期间每天进行温度测定。堆完肥后，将最后取的样进行自然晾干，晾干后用粉碎机粉碎以备测各种指标时使用。测定各项指标测定包括堆肥温度、pH值、CN、种子发芽率、电导率、全氮、全磷、全钾、全碳、有机质、有机碳、腐殖酸。表2堆肥材料理化性质表3.6菌株的鉴定参照《真菌鉴定手册》对筛选所得的木质素降解菌YZC9进行形态特征观察和初步鉴定。分子生物学鉴定采用ITSrDNA测序分析。PCR扩增和序列测定：提取菌株总DNA为模板，PCR扩增其ITS序列。设计引物序列FR1：AICCATTCAATCGGTAIT，NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC。PCR扩增体系:DNA70ngμL模板2μL；dNTPMixture2.5mmolL2.5μL；FR120μmolL1.5μL；NS120μmolL1.5μL；10×ExTaqBufferMg2+pluse5μL；ExTaqDNA聚合酶5UμL0.2μL；补足ddH2O到50μL。PCR条件：94℃预变性3min；然后94℃变性1min、50℃退火1min、72℃延伸2min,共30个循环；最后72℃延伸5min。由上海美吉生物医药科技有限公司对纯化后的PCR产物进行测序，将测序结果在NCBI数据库中进行BLAST，然后用MEGA7.0软件进行系统发育树的构建。4结果与分析对土壤菌种初步的分离与纯化，从中分离纯化50种，从50种菌种种筛选出1种既能降解木质素又能降解纤维素的真菌YZC9。4.1YZC9降解木质素能力分析将纯化后的YZC9菌种接于PDA-愈创木酚培养基上培养和PDA-苯胺蓝培养基上，发现其既能显色也能脱色分别如图2和图3所示。说明YZC9具有降解木质素的能力。分泌胞外酶系统来降解木质素是微生物降解木质素的主要途径。其中涉及到的木质素降解没主要包括木质素过氧化物酶LiP、锰过氧化物酶MnP和漆酶Lac。这些酶一般合称为木质素降解酶。对筛选出YZC9菌，进行下一步产酶试验。LiP、MnP产酶实验结果如下图4所示，向平板内打孔处滴加现配的等量4％与1％焦酚混合液，YZC3出现黄褐色显色圈，证明该菌能产生LiP、MnP酶。Lac产酶实验为向平板内打孔处滴加0.1molL用96％乙醇配制的α-萘酚溶液，YZC3出现紫色显色圈如图5，证明此真菌能产生Lac。对YZC9木质素分解酶活力进行测试，如图6所示，发现YZC9具有较强的产LiP能力，并YZC9在第8天出现峰值，其活力为11.469Uml。YZC9产MnP能力略强，在10-12d出现酶活力高峰，峰值为116Uml。YZC9产Lac是在第7d出现活力峰值，峰值为8.889Uml。4.2YZC9降解纤维素能力分析YZC9通过CMC-Na水解圈测定法进行纤维素降解能力的测定，如图7所示，实验结果显示YZC9分解纤维素能力较强，DP值达到10。进一步对YZC9进行滤纸的降解实验，如图8所示，根据滤纸的破碎程度判断其分解纤维素的能力，滤纸分解的越彻底则其分解纤维素的能力越强，反之则越弱。结果显示培养第十天，滤纸片被分解碎化，培养基近似糊状。说明YZC9具有很强的纤维素分解能力。对YZC9纤维素分解酶活力进行测试，结果如图9所示，发现对于滤纸酶来说，YZC9在生长到第2d时达到峰值，峰值达到6.02Uml，随后呈下降的趋势。对于外切β-葡聚糖酶来说，YZC9在第3d酶活上升后，开始下降，并从第5d开始酶活又升高，在第7d达到峰值，达到6.6Uml。对于内切β-葡聚糖酶来说，呈先上升后下降的趋势，在第5d达到峰值，为12.86Uml。4.3YZC9对枯枝落叶堆肥的影响4.3.1YZC9对堆肥腐熟的影响腐熟度是堆肥中的有机物经过矿化、腐殖化后达到稳定化的程度，是衡量堆肥产品质量好坏的一个综合指标，可以根据堆肥的温度、CN、电导率、pH值和GI来判断。温度是判断堆肥腐熟程度的重要指标之一，堆肥过程会历经升温期，高温期，降温期和后熟期4个时期，当温度重新回到环境温度即可视为堆肥初步成熟。中国粪便无害化卫生标准GB7959-87规定，堆肥温度在50℃以上并持续5-7d，便符合粪便无害化卫生标准。如图10所示，YZC9堆肥初期温度快速升至最高，持续10d后下降至50℃以下，经过较长的后熟期后，温度回归到环境温度。如表1所示，YZC9处理的高温天数比CK多5d，说明YZC9有利于堆肥发酵及高温时间的延长。CN是判断堆肥腐熟程度的另一重要指标，CN越低表明腐熟程度越高，当CN达到20-30，则认为堆肥基本腐熟。如表1所示，各处理之间差异性显著，说明YZC有助于堆肥的腐熟，降低碳氮比。电导率和pH也是判断堆肥腐熟程度的指标。电导率是以数字表示的溶液传导电流的能力，离子浓度越高，导电能力越强；离子浓度高则表明堆肥材料分解的多，堆肥腐熟程度越高。如表1所示，YZC9处理的电导率显著高于空白处理，说明YZC9有利于堆肥材料分解和堆肥腐熟。按照国家标准，固体有机废物堆肥处理后pH应在5.5-8.5，由表1可知，各处理的pH均在堆肥标准范围内。种子发芽指数GerminationIndex,GI不仅可以体现堆肥的植物毒性，还能够判断堆肥的腐熟程度，通常认为，当GI达到80％-85％，堆肥已无植物毒性或者说堆肥已腐熟。由表1可知，YZC9的发芽指数均大于80％已腐熟，显著高于对照的发芽指数，而对照显然在堆肥31天后，还未成熟。表3菌剂堆肥腐熟程度指标4.3.2YZC9对堆肥品质的影响堆肥中TN、TP、TK以及腐殖质的含量是评价肥料的重要指标，全效养分含量越高，堆肥品质越好。如表4所示，加入YZC9的堆肥中TN、TP含量均显著高于空白对照，说明该菌有助于减少堆肥过程中氮素的损失，和加速磷元素的矿化过程。在堆肥过程中，原料中的有机质在降解的同时还进行着腐殖化过程。腐殖质含有大量的官能团如羧基、酚羟基等，能够吸附和固定重金属离子，因此，腐殖质的生成对于堆肥品质有重要影响。作为腐殖质的主要组成部分，腐殖酸的形成与木质素的降解密切相关。通过测定腐殖酸的含量，可以判断堆肥的腐殖化程度以及堆肥品质。如表4所示，YZC9处理的堆肥中腐殖酸含量显著高于空白对照CK，说明YZC9能够加速木质素降解，形成腐殖酸，有助于堆肥的腐殖化。表4堆肥养分指标4.4菌种鉴定结果CYZ9在PDA培养基上生长迅速，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径50～55mm，白色，局部表面橙色，稀疏絮状；背面浅褐色，无水溶性色素。营养菌丝初期无色，壁光滑，后期深褐色，壁明显粗糙，具分隔，分枝多，宽1.5～4.0μm；无锁状联合现象图11。将PCR扩增获得的ITS序列在NCBI上进行BLAST，然后使用软件MEGA7.0将YZC9与同源性较高的10株菌进行系统发育树的构建，如图12所示。经分子生物学鉴定，确定YZC9为密孔菌Pycnoporussp.将该菌株送保藏，其保藏号为CGMCCNo.14783。SEQUENCELISTING110北京农学院120一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9及其应用130P180800BNX1603170PatentInversion3.5210121118212DNA213ArtificialSequence220223密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9ITS序列上游引物FR1220221misc_feature2222..2223I220221misc_feature22217..17223I4001anccattcaatcggtant18210221119212DNA213ArtificialSequence220223密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9ITS序列下游引物NS14002gtagtcatatgcttgtctc192103211604212DNA213ArtificialSequence220223密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9ITS序列4003tcgtaacaaggtttccgtaggtgaacctgcggaaggatcattaacgagttctgaaagggg60ttgtagctggccttccggggcatgtgcacaccctgctcatccactctacacctgtgcact120tactgtaggtttggcgtgggcttcggggcctccgggtctttgaggcattctgccggccta180tgtatcactacaaacacataaagtaacagaatgtattagcgtctaacgcatctaaataca240actttcagcaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataa300gtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgctcctt360ggtattccgaggagcatgcctgtttgagtgtcatggaattctcaacccacacgtccttgt420gatgctgtgggcttggacttggaggcttgctggccctcgtcggtcggctcctcttgaatg480cattagcttgattccgtgcggatcggctctcagtgtgataattgtctacgctgtgaccgt540gaagcgtttggcgagcttctaaccgtcctgtatgggacaacctcttgacatctgacctca600aatc604

权利要求：1.一株密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，其保藏号为CGMCCNo.14783。2.用于降解木质素和或纤维素的菌剂，其包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。3.根据权利要求2所述的菌剂，还包括制备菌剂常用的辅料；优选地，所述辅料选自溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。4.一种木质素和或纤维素的生物降解剂，其包括权利要求1所述的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，和或，权利要求2或3所述的菌剂。5.一种木质素和或纤维素的生物降解方法，包括将保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9与木质素和或纤维素接触。6.根据权利要求5所述的生物降解方法，其特征在于，将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9用于堆肥、将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9用于堆肥、或用于与秸秆类农业废弃物、果园废弃物、园林绿化废弃物、动物粪便接触；具体地，所述秸秆类农业废弃物包括小麦秸秆、玉米秸秆、水稻秸秆；所述动物粪便包括牛马羊粪便。7.一种生产锰过氧化物酶的方法，包括：培养保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9，从该菌株培养物中提取锰过氧化物酶。8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述培养指将所述密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9置于产酶培养基中发酵培养；优选地，所述产酶培养基包含如下物质：葡萄糖10gL，酒石酸铵2mmolL，吐温800.05gL，KH2PO42gL，MgSO4·7H2O0.5gL，CaCl20.1gL，VB11mgL；含有如下成分的微量元素混合液：氨基乙酸0.5gL，MgSO4·7H2O3gL，NaCl1.0gL，CoSO40.1gL，CaCl2·2H2O0.1gL，FeSO4·7H2O0.1gL，ZnSO4·7H2O0.1gL，CuSO4·5H2O0.01gL，AlKSO42·12H2O0.01gL，H3BO30.01gL，Na2MoSO4·2H2O0.01gL，MnSO4·H2O0.1gL；pH4.5的醋酸缓冲溶液10mmolL；优选地，所述培养条件为35℃，150rmin摇床中培养72h后再培养48h；优选地，所述提取锰过氧化物酶指，将培养后的培养基用纱布过滤，将滤液于4℃，10000rmin离心机离心15min，取上清液即得包含了所述锰过氧化物酶的粗制酶液。9.用于园林废弃物堆肥的制品，其特征在于，所述制品包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9；优选地，所述的制品，其特征在于，还包括用于园林废弃物堆肥的常规成分。10.用于园林废弃物堆肥的添加剂，其特征在于，所述添加剂包括保藏号为CGMCCNo.14783的密孔菌Pycnoporussp.菌株YZC9。

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